作为苯二氮卓类药物的代表药物，地西泮(DZP)起到镇静安眠的作用，在临床上广泛用于焦虑症和抑郁症的治疗。然而，DZP也常被非法作为动物抗应激药物使用，甚至非法添加到镇静保健品中，严重威胁动物源性食品卫生安全和人类健康。大量使用的DZP通过各种途径排放进入环境中导致水体环境污染普遍存在。文献报道水体环境中存在地西泮的5种氯化消毒副产物，因此需要深入探讨DZP氯消毒副产物的分布和毒性调控机制，为生态风险和人群健康提供依据。
北京市疾控预防控制中心邵兵研究员团队和中国农大动物医学院合作在《Talanta》发表了《Distribution visualization of the chlorinated disinfection byproduct of diazepam in zebrafish with desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging》，又在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了题为《Chlorine disinfection byproduct of diazepam affects nervous system function and possesses gender-related difference in zebrafish》的研究论文。两篇文章通过解析电喷雾电离质谱成像，直观高效地分析了地西泮氯化消毒副产物中的2-甲胺基-5-氯二苯甲酮(MACB)在斑马鱼体内的分布及其代谢产物，同时利用主成份分析和偏最小二乘法对数据进行深度分析，探讨了MACB对斑马鱼的神经毒性影响和性别差异。
01
样品制备
4月龄的斑马鱼暴露于浓度为1 μg/L MACB中，分别于暴露后24h、48h、72h、96h利用麻醉剂安乐死，然后包埋于盛有5%羧甲基纤维素的锡纸盒中，立刻保存于-80 ℃冰箱。利用冷冻切片机将斑马鱼切成厚度为50 μm贴于载破片上，进行DESI-MSI分析。
02
DESI实验条件
采用配备有DESI源的Waters Xevo G2-XS QTof 质谱仪进行成像实验。
DESI参数：雾化气体（氮气）
压力：0.45 MPa
喷雾溶剂：80% MeOH、20% H2O（含0.1%甲酸和0.1 mM亮氨酸脑啡肽），流速为3 μL/min
毛细管电压：4.5 kV
电离方式：正离子模式，扫描质量范围m/z 100 - 1,000，像素大小为200 μm，扫描速率400 μm/s 。
01
DESI定量的探讨
分别将5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、125 μg/mL、500 μg/mlL取1 μL轻轻点在没有MACB暴露下斑马鱼切片的背侧区，置于室温晾干，用DESI-QTOF分析。
图1. MACB在斑马鱼脊背侧区部分建立额标准曲线。
02
利用DESI获得MACB在斑马鱼体内的分布
DESI-MS成像结果显示，MACB通过血脑屏障进入斑马鱼的脑部位。雌性斑马鱼暴露MACB 24h后，MACB分布于斑马鱼全身，随着时间推移，MACB在斑马鱼体内的含量逐渐降低，但是在雄性体内MACB的分布趋势与雌性斑马鱼相反，存在明显性别差异。
图2. 不同时间点暴露下MACB在雌性、雄性斑马鱼体内分布。
另外，MACB可在斑马鱼不同组织中积累，根据前面建立的标准曲线（范围是5 μg/mL - 500 μg/mL）,斑马鱼体内的MACB浓度在5.22 - 174.22 μg/mL，DESI质谱成像可用于测定MACB在斑马鱼体内的分布和半定量，以上结果表明利用DESI-MS成像技术可以很好地探索目标化合物在生物体内的分布。
03
利用DESI-MS获得MACB在斑马鱼体内的代谢物
同时通过DESI-MS成像分析，发现质荷比m/z 230.0818的物质在斑马鱼体内的时空分布趋势与母体化合物MACB一致，这表明m/z 230.0818是MACB的代谢物质。MACB的代谢物在雌性斑马鱼分布趋势与雄性斑马鱼相反，也存在明显的性别差异。
图3. MACB的代谢物m/z 230.0833在斑马鱼体内的分布。
04
利用DESI-MSMS对MACB的代谢物m/z 230.0833进行定性分析
DESI是一种相对无损的分析技术，在同一个切片上先进行DESI-MS分析，再进行DESI-MSMS分析。文章分别对MACB和m/z 230.0833进行二级质谱图成像分析，根据母离子和子离子的精确质量数，可以推断代谢物m/z 230.0833的结构为MACB脱甲基成环。
图4. MACB 在斑马鱼切片上的二级质谱图。
图5 . MACB的代谢物在斑马鱼切片上的二级质谱图。
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05
利用DESI进行空间组学分析来解释MACB的神经毒性和性别差异
为探讨MACB对斑马鱼体的神经毒性和性别差异，将斑马鱼脊髓的物质进行PCA分析，发现MACB暴露后体内物质具有组间差异。同时通过OPLS-DA对72h和空白对照组进行分析，m/z 104.1079、m/z 118.0870、m/z 132.0778等内源性物质具有显著性差异，分别是胆碱、缬氨酸、肌酸。同时为了验证MACB是否干扰体内氨基酸的稳态，又用了传统的高效液相色谱法检测斑马鱼体内的氨基酸含量。
图6. MACB暴露0h、24h、48h、72h斑马鱼脊髓部位的PCA图。
图7. MACB暴露0h、72h斑马鱼脊髓部位的S-Plot图。
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DESI-MSI在环境暴露组学和环境毒理的应用证明了其强大的功能和实用性。本研究通用DESI-MSI技术探究了地西泮的消毒副产物MACB在斑马鱼体内的分布和代谢。利用DESI-MSI得到MACB及其代谢物在斑马鱼的分布，并且通过DESI-MSMS对新的代谢物进行定性分析。通过DESI-MSI进行空间组学分析，对MACB对神经系统影响和性别差异进行深度分析。
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