简介
高纯度的基因治疗用腺相关病毒（AAV）可通过亲和层析捕获实现。但由于缺乏时间和给料供应，无法进行有力的工艺开发，往往导致不理想的收率和高成本。
高通量筛选（HTS）方法通过使用最低量含AAV的澄清细胞培养物，实现快速优化的AAV纯化，方便用于工艺验证转移和下游规模扩大的纯化工艺。
本次研究中，我们使用Tecan® Fluent®自动化工作站和4种预装了市售亲和层析填料的0.2mL RoboColumn®微型层析柱（填料：Capto™ AVB；POROS™ CaptureSelect™ AAVX和AAV8，以及新推出AVIPure® AAV8），在不同的工艺条件下同时进行测试。本次研究在5小时内进行，包含48个全因子DoE实验，使用低于150mL的澄清细胞培养物，评估了不同层析填料在多个CIP循环对病毒收率、病毒纯度和填料可重复使用性的影响。数据显示了AVIPure®填料的多样性，它是一款在多种CIP循环（包含0.5M 氢氧化钠）下，唯一能够保持高结合载量、高病毒收率和纯度的AAV亲和填料。
本次研究不仅证实了HTS RoboColumns®微型层析柱的优势，即利用有限的样品量快速确定层析纯化工艺条件；而且证明了使用新的AVIPure®亲和层析填料，可获得可靠的AAV纯化结果，并节省成本。
高通量AAV亲和纯化的优化
1.高通量 RoboColumns® 微型层析柱和Tecan Fluent 780自动化纯化平台
Tecan® Fluent® 780自动化工作站加载Te-Chrom™蛋白纯化模块，便于高通量RoboColumns®纯化柱的使用。
平台优势：
加速纯化过程的开发
使用小体积的样品
将确定的纯化条件转移到预包装层析柱，用于工艺验证和规模扩大
2.优化AAV亲和纯化的DoE实验
1.样本：澄清并浓缩的AAV8原料，病毒颗粒浓度为1.2x1012（vp）/mL
2.实验设计：全因子DOE实验（4×3×4），包括以下条件：
填料：Capto™ AVB, POROS™ AAV8, POROS™ AAVX, 和 AVIPure® AAV8
CIP溶液（接触时间30分钟）：0.5 M NaOH; 0.5 M 磷酸; 0.12 mM 磷酸，0.167 mM 乙酸，2.2% 苯甲醇
CIP循环：最多3次
3.纯化流程：
4.产量和杂质的去除：
每个CIP循环中4种亲和填料的相对收率、HCP和HCDNA对数减少率。
AAV8是唯一能够耐受所有CIP处理（包括NaOH清洗）的填料，并保持高收率和纯度。
其余填料在0.5M NaOH下显示出不稳定性（在第1个CIP循环后收率损失很大）。Capto™ AVB 和 POROS™ AAV8 对所有评估的 CIP 再处理都不耐受。
工艺转移至OPUS®预装柱
经RoboColumns®微型层析柱确定的最佳工艺条件和CIP方法（0.5M NaOH）转移到预装AVIPure® AAV8填料的OPUS® MiniChrom®1mL层析柱。
与RoboColumns®微型层析柱相比，OPUS® MiniChrom® 1mL层析柱的收率、HCP和HCdDNA的清除率以及色谱图都相类似，这表明了工艺的可放大性。
结论
Tecan Fluent® 780自动化纯化平台结合RoboColumns®微型层析柱使用，能够在5个小时内完成全因子DOE实验（4×3×4=48个条件），且只需要小于150毫升的澄清细胞培养物。
AVIPure® AAV8 是一种高性能填料，可耐受碱性、酸性、酒精制剂的清洗，并在多次CIP循环中保持高收率和高纯度的性能。
高效的工艺开发，稳定且高性价比的AAV纯化工艺的选择。
*实验数据由Repligen公司惠赠
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