基于质谱的组学技术在CAR-T研发中的应用

2010年，年仅5岁的Emily Whitehead正遭受急性淋巴细胞白血病的折磨，这是最常见的儿童癌症，在超过16个月的间歇性化疗之后，她的父母被告知Emily的癌症已经复发且无法控制，似乎只有奇迹才能阻止Emily的人生落幕……

但在随后的日子里，Emily接受了一项新的免疫疗法临床试验，在严重的高烧之后，Emily在她7岁生日那天醒来，并在八天后被宣布没有癌症。如今，Emily可能是世界上最有名的癌症病人，但更重要的是，折磨她数年之久的急性淋巴细胞白血病再未出现，而她则在17周岁时被宣布完全治愈。

图1.  Emily whitehead（图片来源：Emily whitehead foundation）

Emily找到了属于她的奇迹，而这种创新性的免疫疗法即CAR-T技术(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，通过基因编辑、基因转导等技术，使T细胞表达能够特异性识别肿瘤相关抗原（Tumor-Associated Antigen, TAA）的嵌合抗原受体（CAR），以实现对癌细胞的杀伤作用。

图2.  CAR-T基本原理（图片来源：Nature medicine）

经过多年发展，当初治愈Emily的CAR-T疗法已被FDA批准（药物名：tisagenlecleucel），在其他血液恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液肿瘤的治疗方面，CAR-T技术同样取得了显著成功，但仍有诸多原因导致在CAR和细胞产品的设计和优化、提高疗效、降低毒性、降低复发率等方面仍然存在挑战，例如许多恶性肿瘤中缺乏高表达的特异性肿瘤相关抗原、CAR-T细胞耗竭等，而基于质谱技术的蛋白质组学和代谢组学为我们克服CAR-T细胞疗法的现存挑战提供了可行的思路。

图3.  CAR-T 发展历程（图片来源：Blood Cancer Journal）

识别特异性高和覆盖率广的CAR靶标是增强CAR-T疗效、降低毒性的基础。因此，理想的肿瘤相关抗原应在所有肿瘤细胞表面特异性高表达；然而，由于肿瘤细胞与非恶性细胞之间存在的共享抗原表达、肿瘤细胞之间存在的高度异质性表达，寻找合适的CAR靶标一直具有挑战性，尤其是在实体瘤中，而基于蛋白质组学的大数据分析模式为我们提供了解决思路：例如通过比较分析肿瘤和非恶性组织样本的蛋白质组学，识别肿瘤细胞上过表达的抗原（overexpressed antigen）和肿瘤细胞特异性新抗原（cell-surface antigen）或 MHC 呈递的新表位（MHC-presented antigen）。

基于质谱的蛋白质组学技术的进步使膜蛋白质组的稳健高通量分析成为可能。肿瘤表面蛋白质组（surfaceome）已成为各种血液学和实体恶性肿瘤的新治疗靶标的来源；Fabiana.P 等人通过建立急性髓性白血病（AML）的细胞表面蛋白质组数据，整合来自恶性和正常组织的转录组学和蛋白质组学注释信息，发现了AML中潜在的CAR靶点；在实体瘤上，利用类似的策略，John.L等人在前列腺腺癌（PrAd）和神经内分泌性前列腺癌（NEPC）中找到了高表达的细胞表面抗原FXYD3和CEACAM5，而靶向CEACAM5的CAR-T细胞在NEPC细胞系中诱发了抗原特异性细胞毒性。

此外，新抗原（neoantigen）也是免疫疗法的理想靶标之一，作为新型肿瘤特异性蛋白质，主要由肿瘤细胞中的体细胞突变产生：HLA-I 呈递的细胞内肽始于基因组区域的转录及其向蛋白质的翻译，沿着这条路径，遗传变异、表观遗传调控、转录物剪接机制、RNA 编辑和异常翻译的存在均可能导致非经典肽（noncanonical peptides）的产生。

通过结合RNA-seq和质谱分析（主要是免疫多肽组学，immunopeptidomics），几种新抗原已被用作治疗血液或实体恶性肿瘤的有前途的CAR靶点。例如EGFR变体III（EGFRvIII）被发现在复发性胶质母细胞瘤中特异性表达，靶向EGFRvIII的CAR-T疗法有明显的肿瘤杀伤作用，且未发现肿瘤外毒性或细胞因子释放综合征，随后开启了多项临床试验（NCT03726515、NCT03283631和NCT03638206），展现出肿瘤新抗原在细胞治疗中的广阔前景。

全面了解影响CAR-T细胞抗肿瘤功效的生物学因素对于实现稳健和持久的治疗反应并最大限度地提高临床效益至关重要，而这主要受到四个维度的影响：T细胞状态、肿瘤细胞特征、肿瘤微环境和微生物群。

首先是CAR-T细胞本身的状态，举例而言，即便是CAR-T细胞产品内部也具有高度异质性，输注到晚期慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的CAR-T细胞的不通基因表达类型会造成完全缓解（CR）与部分反应或无反应的两种截然相反的结局。可见，CAR-T细胞内在特征，包括特定基因的表达（例如关键转录因子）、表观遗传特征、代谢状态及细胞内信号结构域，都与疗效相关。例如，有研究发现PRODH2（一种参与脯氨酸代谢的酶）的上调能够增强CAR-T细胞的功能，转录组学和代谢组学分析表明敲入PRODH2的CAR-T细胞代谢和免疫活性增强，并在多种小鼠模型中展现出更高的抗肿瘤活性。此外，通过磷酸化修饰蛋白质组学结合靶向蛋白质组定量所有CD3链在TCR刺激下的免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM）的磷酸化水平，发现CD3ε ITAMs能够特异性地招募抑制性的CSK激酶来减弱TCR信号传导，而将CD3ε细胞质结构域添加到 CD19-CD28-CD3ζ CAR构建体中能提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性、降低细胞因子释放水平。

CAR-T细胞疗法的毒性仍然是其广泛应用的重大阻碍，在杀死表达抗原的靶细胞的过程中，CAR-T细胞通过分泌各种细胞因子和趋化因子诱导一系列炎症反应——这是一把双刃剑，可增强抗肿瘤免疫反应，但也可能导致严重毒性。最常见的CAR-T细胞诱导的不良事件包括细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关的神经毒性综合征（ICANS）、长期血细胞减少等。

 图8. CAR-T细胞诱导的毒性（图片来源：Nature Reviews Clinical Oncology）

细胞因子释放综合征（CRS）是由与靶细胞结合后的CAR-T细胞，以及随后激活的内源性免疫细胞释放大量细胞因子的结果，这会产生一个免疫激活循环，从而导致“细胞因子风暴”。转录组学方法发现免疫细胞中IL-1 受体和 IL-6 的表达增加，尤其是巨噬细胞，会导致更严重的CRS；在此研究基础之上，通过对来自51名接受CD19定向CAR-T细胞疗法的患者进行血清蛋白质组学分析发现，细胞因子特征能够准确地预测了严重CRS的发生，从而增加早期干预实现的可能性。

目前用于临床和/或正在临床试验中的大多数CAR-T细胞产品的靶点都具有一定程度的非肿瘤细胞表达，这可能对非恶性组织造成损害，并导致脱瘤毒性。而在治疗期间通过多组学分析靶点表达水平并预测脱瘤毒性风险可能会更有效地管理此类不良反应。MacKay.M等人通过结合转录组学和蛋白质组学数据，报道了一个候选靶点的图谱，包括100余种单一靶点和十万余种组合靶点，预测毒性最小。

CAR-T细胞疗法已经改变了B细胞恶性肿瘤的诊疗流程，但由于目前存在的种种问题，例如CAR-T细胞功能差和/或肿瘤细胞耐药性，大量患者没有临床反应或疾病复发。此外，由于缺乏合适的靶点、疾病复发的可能性和治疗相关的不良事件等一系列挑战，CAR-T细胞疗法的适用性仍然有限。而基于质谱的蛋白质组学、代谢组学技术为解决这些问题提供了可行的思路，为我们大规模筛选靶点、深入理解治疗效果和毒性的潜在机制和关键调节因子、优化CAR-T细胞工艺提供了丰富的多维度资源。

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