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走进微藻的世界，探索微藻的魅力
微藻是在水系统中生长的光合作用生物体，可将大气中的 CO2 转化为碳水化合物、脂质和其他生物活性化合物等有机分子。由于这些生物学特性，微藻是一种可再生和可持续的食品成分来源，包括食品和饮料行业适用的无动物来源 Omega-3、可替代蛋白质和天然色素。
微藻满足饮食需求的潜力引起了食品行业的关注。根据欧洲食品安全局（EFSA）的数据，消费者对天然食用色素的需求正在增加，他们更喜欢天然产品，而不是可能有潜在毒性的合成食品添加剂[1]。然而，天然色素可能对光照敏感，当暴露在不同的环境条件（ pH 和温度）下时会变色；此外，它们的颜色范围通常有限。所有这些因素都促使人们围绕被用作食品染料的新型天然色素进行研发。
食品工业中具有独特特性的微藻色素的发现，需要高通量自动化的方式，以在更短的时间内筛选大量微藻藻株。利用这项技术，Fermentalg 实验室利用 Galdieria sulphuraria 的代谢产生了一种富含 C- 藻蓝蛋白的天然蓝色色素，被提取并商业化为 BLUE ORIGINS[2]。
(BLUE ORIGINS 与其他微藻衍生染料相比，BLUE ORIGINS 是一种天然色素，具有在低 pH 和高温下的稳定性等特性，在食品和饮料行业有广泛应用，如糖果、饮料和即食谷物等。迄今为止，C- 藻蓝蛋白是 FDA 的食品着色剂豁免产品清单中唯一的蓝色颜料，适用于生产天然产品[3]。)
Fermentalg 科学家开发了一种创新的方法，使用 QPix 420 微生物克隆筛选系统（Molecular Devices）筛选和挑取微藻藻株。传统上，克隆挑选是使用无菌移液管尖端或接种环手动进行的，这通常是缓慢、劳动密集和耗时的。QPix 420 系统允许高通量克隆挑取，可达 3000 克隆/ h，挑取效率 > 98 %。多种荧光通道增加了系统灵活性，能够根据荧光蛋白表达或荧光色素的形态特征和水平对独特克隆进行表型筛选。
实验方法
在寻找一种高产 C- 藻蓝蛋白的 Galdieria sulphuraria 藻株过程中，Fermentalg 获得并保存了一组具有不同 C- 藻蓝素含量的变体。首先将藻株接种在 Gross-agar 培养基[4]（pH3）上，并在 37°C、60% 湿度环境中避光培养两周。然后使用 QPix 420 系统对所有培养板进行成像和分析，通过使用圣诞树形状的倒钩型挑针成功地挑取并进行接种。通过使用内部清洗模块对针进行在线消毒来保持无菌（图1）。
（QPix 提供多种形状和直径的挑针来确保与不同微生物的兼容性，提高挑取效率。）
图1. 使用 QPix 的克隆筛选流程
用荧光法筛选 G.sulphuraria 藻株
G.sulphuraria 富含 C- 藻蓝蛋白，一种在蓝绿藻中发现的水溶性蛋白，呈现特有的亮蓝色。当用红光激发时，C- 藻蓝蛋白发射荧光，峰值在 642 nm[5]。
在透射光和荧光下， QPix 对两周大的 G.sulphuraria 克隆进行成像和筛选，这使得能够客观地鉴定和选择产生 C- 藻蓝蛋白的克隆。首先，通过 QPix Fusion 软件获取透射光和所选荧光下的板的测试图像（图2A&B）。
图2. A) 微藻 G.sulphuraria 在透射光下的测试图像。B) 在荧光通道 (Ex/Em 滤光片：628/692 nm) 中获得相同样品的测试图像，以检测表达 C- 藻蓝蛋白的克隆。
一旦捕捉到图像，QPix Fusion 软件就会根据特征特性对其进行分析，并确定培养板（培养皿、Omnitray 或 QTray）上单个克隆的位置。Fusion 软件的灵活性允许用户根据菌落大小、紧凑度、轴比、直径和最小临近度等筛选所需的克隆。因此，基于设置的参数，符合的 G.sulphuraria 克隆被包括在内（图3，黄色），不符合的被排除在外（图3、红色）。
图3. 符合设置参数的被选中，显示为黄色。不符合设置参数的被排除，显示为红色。右上角面板：为准确筛选克隆而设置的筛选标准。
定量的荧光强度阈值指定了所需的蛋白质表达水平。为了选择含有最高浓度 C- 藻蓝蛋白的克隆，需要调整荧光强度范围。对于该实验，选择产生平均荧光强度（MFI）值在 36000 和 43000 之间的 C- 藻蓝蛋白的克隆（图4A&B）。一旦根据用户定义的标准进行选择，就可以使用 QPix 420 系统准确地挑取克隆。
图4. 产生 C- 藻蓝蛋白的 G.sulphuraria 克隆的荧光筛选。A) 表达不同水平的 C- 藻蓝蛋白的 G.sulphuraria 克隆的代表性荧光图像，使用红色荧光通道 ( Ex/Em : 628/692 )。B) 荧光直方图显示为选择的平均强度。
高表达 C- 藻蓝蛋白克隆的筛选与检测
最后，使用 QPix 420 系统分析了产生不同含量 C- 藻蓝蛋白的不同 G.sulphuraria 藻株，以测试 QPix 区分和选择高表达 C- 藻蓝素克隆的能力，这些克隆在视觉上看起来是深绿色的（图5A）。正如预期的那样，具有低浓度的 C- 藻蓝蛋白的克隆在琼脂平板上呈现白色，而表达平均水平的克隆呈现浅绿色。因此，用 QPix 420 在透射光中对不同克隆进行成像，然后基于 C- 藻蓝蛋白荧光强度进行筛选（图5B&C）。检测到深绿色和浅绿色菌落的荧光信号。特别地，基于先前设置的 36000 至 43000 的平均荧光强度值，成功地选择和挑选了深绿色克隆。最后，荧光成像中白色克隆的消失证实了这些克隆中不存在 C- 藻蓝蛋白。
图5. 高表达 C- 藻蓝蛋白克隆的筛选。A) 对具有不同色素沉着的G.sulphuraria 克隆进行了分析。B) 用 QPix 420 相机检测到的同一克隆板的透射光( TL )图像。C) G.sulphuraria 克隆的荧光图像（红色荧光通道，Ex/Em : 628/692 nm），被选择的克隆显示为黄色，被排除的克隆显示红色。
总结
由于对天然和可持续食品成分的需求增加，食品行业对微藻的兴趣正在上升。Fermentalg 正在利用微藻代谢来开发和筛选多种能产生低 pH 值和高温稳定的天然蓝色色素作为食品成分的 G.sulphuraria 藻株（BLUE ORIGINS）。为了加速该产品的工业应用，进行了 G.sulphuraria 藻株克隆的自动化筛选。与传统筛选方法相比，高通量克隆筛选具有显著优势，包括更快地鉴定所需克隆，从而简化后续的下游分析。QPix 荧光能力用于选择产生更高浓度 C- 藻蓝蛋白的克隆，从而加快了基于微藻的天然色素生产的规模。总之，高通量自动化对微藻产品的未来发展前景广阔。
参考文献
1. Carocho M, et al. Adding Molecules to Food, Pros and Cons: A Review on Synthetic and Natural Food Additives. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2014 Jul;13(4):377-399. doi: 10.1111/1541-4337.12065. PMID: 33412697
2. Athane et al., The safety evaluation of phycocyanin-enriched Galdieria sulphuraria extract using 90-day toxicity study in rats and in vitro genotoxicity studies. Toxicology Research and Application 2020.
3. Minxi Wan et al., Comparison of C-phycocyanin from extremophilic Galdieria sulphuraria and Spirulina platensis on stability and antioxidant capacity, Algal Research 2021, Volume 58.
4. Gross, W. & Schnarrenberger, C. (1995): Heterotrophic growth of two strains of the acido-thermophilic red alga Galdieria sulphuraria. Plant Cell Physiol. 36(4): 633-638.
5. Niels T. Eriksen, Production of phycocyanin—a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008.
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