全长转录组研究是理解生物机体功能的一个重要途径。传统二代转录组测序无法直接获得单个RNA分子由5ˊ到3ˊ的全部序列。基于PacBio三代测序平台的转录组研究,无需片段打断,直接读取反转录的全长cDNA,能够有效获取高质量的单个RNA分子的全部序列。无需进行转录本的组装,即可准确辨别二代测序无法识别的完整的、准确的可变剪接、转录起始位点,能够有效的获取高质量的单个mRNA分子的序列信息。
产品优势:
无需组装,直接测序获得全长mRNA和lncRNA转录本;
可准确识别可变剪接形式,检测新基因和新的基因亚型;
无参考基因组情况下,解析物种特有基因或基因家族;
提高无参转录组研究的定量准确性。
测序实验流程图:
技术路线:
分析内容:
测序Reads质量质控(QV);
测序Reads聚类;
转录本全长评估;
基因结构优化;
新转录本的预测;
转录本功能注释;
基因融合分析;
可变剪接鉴定;
等位基因分析(基于同一样本的二代数据);
非编码RNA及其靶基因预测;
SSR分析;
SNP分析(基于同一样本的二代数据);
CDS预测;
样品要求:
1. 样品类型:总RNA;
2. 样品浓度:≥300 ng/ul;
3. 样品总量:≥1ug;
4. 样品纯度:OD260/280为1.8~2.2,OD260/230≥1.0,260nm处有正常峰值;无基因组DNA污染;
5. RNA完整性:电泳检测28S/18S≥1.5。(据送样日最近的电泳结果)
1、单分子全长测序揭示玉米转录组的复杂性
玉米(Zea mays)是全球重要的农作物,也是研究转录组代谢通路的重要遗传模型。本文用PacBio长读长测序技术,得到六个组织(根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗)共111151个转录本,覆盖玉米RefGen_v3基因组已注释基因的70%。57%的转录本是新发现的,有些是组织特异性的或者已知基因的Isoform。此外,还发现大量的新lncRNAs和融合基因转录本。DNA甲基化也产生各种Isoform。结果显示,玉米B73转录组的数据还远远没有完成,玉米基因组的表达也比以往预期的更复杂。
全长转录组测序PacBio与RefGen_v3中Isoform的比较
2、利用三代测序long-read生成个人转录组
本研究利用Pacific Biosciences系统,对三个家庭成员的类淋巴母细胞转录组进行了测序,并将获得的reads与Illumina平台上获得的较短reads进行比较。通过这些转录组,开发出一名家庭成员的等位基因特异的全长转录组,能够区分两个等位基因。
单一基因的定相
参考文献:
1.Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing.(Nature communication,2016,IF=11.329)
2.Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome.(PNAS,2014,IF=9.423)