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价格:
200
PKC活性检测
产品属性
品牌
研谨生物
产地
上海
型号
PKC活性检测
关注度
0
信息完整度
关闭
产地:上海; 品牌:研谨生物
上海研谨生物科技有限公司
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产品描述
提供商
:
上海研谨
生物
服务名称
:
PKC
活性检测实验
规格
:
实验服务
价格:
200
元
收费标准
/
服务周期
/
提供结果
:
欢迎咨询详谈,我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
更多实验技术服务请浏览网站其他内容
,
或来电详询
!
PKC活性检测实验
实验试剂
:
琼脂糖
(Promega
公司,
V3125) ;
其他常备试剂购自
sigma
公司
; PKC
活性检测试剂盒
(Promega
公司,
V5330)
实验仪器
:
电泳仪
(
北京六一厂,
112-0640) ;
水平电泳槽
(
北京六一厂,
122-3146) ;
电热恒温培养箱
(
碧云天生物,
EBI025) ;
电热恒温水浴锅
(
江苏省金坛市环宇科学仪器厂,
HH-8)
基本原理
:
分离
PKC
蛋白
(
磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白
)
,利用试剂盒组分将
2
种蛋白分离并加以区分
,
利用电泳琼脂糖凝胶技术显示
2
种不同的蛋白,利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较,以磷酸化
PKC
非磷酸化
PKC
灰度值
IOD
的比值显示
PKC
活性
(PKC
活化度
)
。
操作步骤
:
1.
用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2.
在
4
°
C
,用
14,000 xg
离心裂解液
5
分钟,保存上清。
3.
用
PKC
抽提液预平衡
1ml
的
DEAE
纤维素柱,再把第
2
步中得到的上清过柱。用
5m
的
PKC
抽提液洗柱子,然后用
5ml
含有
200mM NaCI
的
PKC
抽提液洗脱含有
PKC
的组分。
4.
用
PKC
稀释液
(PKC dilution buffer)
将少量
蛋白激酶
C
(Promtein Kinase C)
稀释到
2 .5ug/ml.
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5.
用探头超声波破碎仪超声处理
PKC Activator Solution 20-30
秒
,
或直到溶液变温暖。
6.
对每一个样品,按照下面所列顺序在
0.5ml
小离心管中混合
PepTag@ PKC 5x Buffer,PepTag@ C1Peptide,
超声过的
PKC Activator 5X Solution,
和水。在样品加入之前,小离心管
--
直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值
(
说明书第
IV
部分
)
。
标准
PKC
检测
PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer
5ul
PepTag@ C1 Peptide (0.4ug/ul)
5ul
PKC Activator 5X Solution,
超声处理的
5ul
短肽保护液
(
非必须
)
1ul
样品
9ul
去离子水使终体积为
25ul
PKC
阳性对照检测
PepTag
⑧
PKC Reaction 5X Buffer
5ul
PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)
5ul
PKC Activator 5XSolution,
超声处理的
5ul
短肽保护液
(
非必须
)
1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml
溶于
PKC dilution bufer)
4ul
去离子水使终体积为
25ul
PKC
阴性对照检测
(
不加
PKC)
PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer
5ul
PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)
5ul
PKC Activator 5XSolution,
超声处理的
5ul
短肽保护液
(
非必须
)
1ul
去离子水使终体积为
25ul
7.
在
0
时间点,把
--
支管子从冰上移到
30
°
C
水浴中孵育
2
分钟。然后加入样品或蛋白激酶
C
在
30
°
C
再孵育
30
分钟。
8.
把管子放进开水浴或
95
°
C
加热块
10
分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品
--
直避光存放在
4
°
C
或
-20
°
C
。
9.
把样品上样到胶上之前,往每个样品中加进
1ul
的
80%
甘油,以确保样品保留在上样孔中
(
说明书第
II.F
部分
)
。
10.
每孔点样
10ul,
在
0. 8%
琼脂糖凝胶上以
100V
电泳
15
分钟分开样品,拍照。
检测结果
:
说明
:
后面
2
组泳道“阳性
(PC)"
和“阴性
(NC)"
为试剂盒自带系统对照。
注
:
阳性条带以
Gel pro4
版凝胶光密度分析软件进行分析
,
测其
IOD (integrated optical density)
累积光密度参考值。按照百分比例计算
PKC
活性百分比
(
以阳性对照
I0D
值为
100
,其余各组的
PKC+ p-PKC
总和为
100
分配
IOD
数值
)
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