多色流式(flow cytometry, FCM)
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是一项新型的 、发展迅速的生物医学分析技术,它是集激光技术 、光电测量技术、 计算机技术、 流体力学以及细胞免疫荧光化学技术 、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。
【技术原理】
流式细胞仪是应用流式细胞术建立起来的仪器装置。它使细胞或微粒在液流中流动，逐个通过一入射光束，并用高灵敏度检测器记录下散射光及各种荧光信号，从而得以对粒子进行多参数分析，包括诸如粒子形状和大小、细胞周期、细胞内细胞因子、细菌表面抗原、细胞DNA内含物等。FCM检测的粒子一般为活性细胞，通过激光光源激发细胞上所标记的荧光物质的强度和颜色以及散射光的强度可以得到细胞内部各种各样的生物信息。 另外FCM还可进行细胞分选,可以根据所检测细胞的某种性质进行分选,并且如果分选的过程是在无菌条件下进行的,这些细胞还可以用来培养。
【工作原理】
将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。
细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
【应用领域】
随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的识别和艾滋病感染者T4、T8细胞的计数。
自70年代以来，随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。
【样本控制】
1）用于流式分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、组织活检物、浆膜腔积液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等等。样本的条件控制可能是免疫表型分析质控最困难的环节之一。每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。首先，观测样本外观：有严重溶血、凝聚或坏死的样本应弃用。
2）单细胞悬液的获取：外周血和骨髓穿刺液为天然单细胞悬液；活检组织常用机械分离和酶消化两种方法。不同的实验要求适用不同的方法。对于需要进行膜抗原标记的，不仅是要获得足够的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性，机械法较适用。只需进行细胞周期或DNA倍体分析的，在机械法的基础上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）较适用。
3）抗凝剂的选择：外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析，则应用EDTA抗凝；对于血小板分析的实验，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD作骨髓穿刺液的抗凝剂。
4）样本的保存：理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时/室温（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小时/室温（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小时/室温（16-25）；对于只作胞内染色的样本，可固定细胞以长期保存。但此“固定－染色”的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式。
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