T7EⅠ试验介绍       T7EⅠ试验指用T7EⅠ(T7 Endonuclease Ⅰ，T7核酸内切酶I)切割编辑后的退火DNA，根据DNA的切割率计算编辑率。T7EⅠ试验是检测CRISPR/Cas9系统编辑率的金标准。
  T7EⅠ试验的原理       T7EⅠ识别并切割不完全配对DNA、十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA、异源双链DNA，或者以更慢的速度切割或切刻双链DNA。T7EⅠ切割错配碱基5′端的第一、第二或第三个磷酸二酯键。
       PCR扩增包括sgRNA靶点的DNA序列。将PCR产物变性退火，则编辑过的单链DNA会与未编辑的单链DNA形成有错配的双链DNA，而T7EⅠ能够切割该有错配的双链DNA。

 T7EⅠ试验流程1、提取转基因细胞或组织的DNA。
2、PCR扩增包括sgRNA靶点的DNA序列。
3、通过切胶回收纯化PCR产物。
4、纯化的PCR产物变性退火。
5、用T7EⅠ切割变性退火后的PCR产物。
6、电泳检测PCR产物的切割结果。
7、用Image J软件分析切割率，根据公式100×（1-（1-fcut）1/2计算编辑率（fcut指切割率）。
8、纯化的PCR产物测序。

 T7EⅠ试验的结果示例

 

图1 T7EⅠ试验的电泳结果


  图2 敲除鉴定测序结果

 

 

T7EⅠ试验服务说明

 

1、客户提供转基因细胞或组织，敲除基因的名称和编号，sgRNA序列。
2、HYY提供检测T7EⅠ切割结果的电泳图、PCR产物测序结果和说明实验过程中所用的耗材、仪器设备和操作过程的实验报告一份。
3、实验周期1～2周。