现在一般都采用亚***酰胺化学合成Oligo DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，合成时从3'→5'方向进行，通常3'端的第一个碱基结合在Glass担体（Controlled Pore Glass，CPG）上。Oligo DNA合成的原理基本相同，主要差别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时的不同。我公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪。

合成的详细过程见图1，现简要说明如下：

图1 Oligo DNA合成原理图。N1代表第一个碱基，N2代表第二个碱基，依次类推。

  第一步，三***和预先连接在固相载体（CPG）上的第一个核苷酸反应（其活性基团处于被保护状态），脱去核苷酸5‘-羟基的保护基团DMT，获得游离的5‘-羟基；

    第二步，活化新的碱基单体（Phosphoramidite)，准备与第一个碱基进行反应；

    第三步，合成DNA的原料（亚***酰胺保护的核苷酸单体）与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚***酸活化中间体，它的3‘端被活化，5‘-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5‘-羟基发生缩合反应；

    第四步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5‘-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉；

    第五步，在氧化剂***的作用下，亚***酰形式转变为更稳定的***酸三酯。（即将三价***氧化成五价***)

（重复进行Step1～Step5的循环，直至合成完所需的Oligo DNA序列）       

  第六步，合成结束后，将Oligo DNA分子从CPG上切下，再进行进一步的纯化。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。连接在CPG上的引物被切下来，通过, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩、脱盐，测定OD260定量，根据定单要求分装。

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