使用仪器

Thermo Q Exactive

 简介
 
同位素标记相对和绝对定量iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术可以在一次实验中对2-8个样品中的蛋白质进行标记和同步分析比较，已经成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一。
 
 应用
Ø 可对血浆、体液、动物组织、植物组织、细胞培养液、细菌及真菌等进行体外标记。
Ø 标记过程中能保留常见的翻译后修饰位点。
Ø 可检测胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，以及低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。
Ø 可进行多个时间点、细胞周期、细胞信号传导整个过程蛋白质组动态变化的监测。
Ø 可分析详细分期型的临床疾病样本，并可设计样本重复，甚至可以进行个体样本的研究。
 
 优点
 
Ø 通量高，结果直观，系统误差zei小。
Ø 节省样品的用量和检测的时间。可同时对2-8个样品进行蛋白差异分析。标记完全，标记效率高达97%以上。
Ø 分离能力强、分析范围广。质谱具备高灵敏度、检测限低。二级碎片离子信号增强，产生质量更高的二级质谱，确保鉴定结果高的可信度。
Ø 定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息。
Ø 自动化程度高。分析时间快，分离效果好。


iTRAQ的8种同位素标记试剂由8种相对分子质量分别为113Da、114Da、115 Da、116 Da、117 Da、118Da、119Da和121Da的报告基团(Reporter group)，相对分子质量分别为192Da、191 Da、190 Da、189 Da、188 Da、187Da、186Da和184Da的平衡基团(Balance group)以及相同的与肽段反应的基团(Peptide reactive group)组成。其中每一种报告基团及与其相应的平衡基团的总分子质量均为305Da。操作时首先对不同蛋白质样品分别进行酶解，对酶解肽段进行不同标记后混合，结合多为色谱分离和串联质谱鉴定，从而实现对不同来源样品蛋白质进行分离、鉴定和定量的目的。
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Ø 节省样品的用量和检测的时间。可同时对2-8个样品进行蛋白差异分析。标记完全，标记效率高达97%以上。
Ø 分离能力强、分析范围广。质谱具备高灵敏度、检测限低。二级碎片离子信号增强，产生质量更高的二级质谱，确保鉴定结果高的可信度。
Ø 定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息。
Ø 自动化程度高。分析时间快，分离效果好。



8个来源不同的相同蛋白样品在一级质谱上表现相同。平衡基团在二级质谱发生中性丢失导致报告基团在二级质谱产生8个报告离子，分别是113Da、114Da、115 Da、116 Da、117 Da、118Da、119Da和121Da。通过分析报告离子的峰强度比值就可以分析同一个蛋白在不同样品间的表达量比值。

实验案例
为了开发新的临床免疫组化生物标记来区分肝细胞癌（sHCC）和发育异常的结节（DN），采用iTRAQ技术来筛选区分癌前病变和肝细胞癌的免疫组化生物标记。
Ø 已发表文献（IF5.12）
iTRAQ-2DLC-ESI-MS/MSBased Identification of a New Set of Immunohistochemical Biomarkers for Classification of Dysplastic Nodules and Small Hepatocellular Carcinoma. J. Proteome Res. 2011, 10, 3418–3428
 
Ø 实验设计
样品取自LC，DN和sHCC三个不同的组织来源。提取蛋白后，分别用115，116，117来标记，混合蛋白并经过SCX柱液相分离后，zei后进入液质系统进行蛋白质谱鉴定。
Ø 结果
共有1951个蛋白被定量，在1.25倍p<0.05的显著差异下得到52个上调蛋白和95个下调蛋白。
挑选出来的候选生物标记进一步通过Western和免疫组化进行验证。进而用ROC曲线和逻辑回归模型来评估生物标记的诊断效果。


zei后ACY1和SQSTM1被选为新的生物标记，而所建立的逻辑回归模型包含ACY1，SQSTM1和CD34。这个模型的敏感性和特异性分别是96.1%和96.7%。
部分iTRAQ技术已发表文献
iTRAQ plus 18O: A new technique for target glycoprotein analysis ,  Talanta, Volume 91, 15 March 2012, Pages 122-127（方法学）
Identification of transaldolaseas a novel serum biomarker for hepatocellular carcinoma metastasis using xenografted mouse modeland clinic samples , Cancer Letters 313 (2011) 154–166 （IF 4.8，血清样本）
iTRAQ2DLCESIMS/MS Based Identification of a New Set ofimmunohistochemical Biomarkers forClassification of Dysplastic Nodules and SmallHepatocellular Carcinoma,J. Proteome Res. 2011, 10, 3418–3428（IF5.12，组织样本）
Analysis of Transcriptional Factors and Regulation Networks in     Patients with Acute Renal Allograft RejectionJournal of Proteome Research 2011, 10, 175–181（IF5.12，血清样本）
Changes in proteomics profile during maturation of  marrow-derived  dendritic  cells treated with oxidized  low-density lipoprotein Proteomics 2011, 11, 1893–190（IF 4.42，细胞样本）
LC-MS/MS Analysis of Ovarian Cancer Metastasis-Related Proteins Using a Nude Mouse Model: 14-3-3 Zeta as a Candidate BiomarkerJ. Proteome Res., 2010,   6180–6190（IF5.12，囊液样本）