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1、常见细胞培养污染及防治

常见污染有细菌污染、霉菌污染、支原体污染、真菌污染、原虫污染等。

2、细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径：

• 不洁的动物组织标本，很多动物组织本该是无菌的，但由于取材时不小心也会有污染的机会。另外有的组织本身含有细菌，如

取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。

• 空气中含有大量的微生物，如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分，很容易造成污染。另外，净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区，也会导致污染。春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。

• 清洗消毒培养用物品、材料洗刷不净，培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。

• 操作来自操作者的污染主要有以下几方面：

- 器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过，或者是否已经消毒灭菌处理过，或者虽经处理，时隔已久又末重新处理。

- 操作者未戴口罩、帽子，呼出气中含有细菌和支原体。

- 培养瓶口未用酒精擦和烧灼。

- 操作者不当心，动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等。

- 操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等

- 细胞倾液时倒出培养瓶或者滴落在超净台上，未及时擦净或者灼烧。

- 移液管吸取液体时将空气中的气流吸入培养瓶中。

- 长时间的将离心管放在离心机中，可能由于口没有完全封闭而造成污染。

- 同一移液管交叉污染多瓶细胞。

- 血清，非正规来源，潜在病毒和支原体污染

1.细菌：

细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，不同的细菌类型，可有不同的外形，培养液一般会快速浑浊变黄，有时候有异味，对细胞生长影响明显。

预防及补救措施：

• 使用LabServ系列耗材，已无菌无热源处理。

• 可在培养液中加相应的抗生素处理，例如双抗青霉素，链霉素。或者四环素，庆大霉素。

• 严格无菌操作

2. 霉菌：

培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差。

解决方法：

• 用硫酸铜溶液擦拭培养箱，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

• 被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/mL的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗。

3. 支原体：

黑色的，好象多为多形,光学显微镜很难观察到，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢si去。

解决方法：

• 支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。要注意的是：支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等，氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用。必要时更换所有培养用物。通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。

4. 真菌：

一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

解决方法：

• 果断扔掉，然后彻底消毒灭菌培养间，CO2培养箱，器皿和培养液。