实验方法

氢盐预处理法检测DNA片段甲基化

来源: 互联网 关键词: 氢盐 预处理 DNA甲基化

1. 基化特异性PCR

甲基化特异性PCR(MSP)是Herman等首先提出的一种检测基因组DNA甲基化水平的常用方法。该法是将DNA经亚硫酸氢钠处理,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。

在PCR反应时,设计两套不同的引物对:一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。

两对引物都具有很高的特异性,与未经处理的DNA序列无互补配对。MSP引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG岛,以保证引物的特异性,经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点,引物覆盖序列中CpG岛所占比例越高,甲基化DNA检出率越高。

该法不足之处在于:引物的选择和设计非常关键,否则易导致假阳性;如果亚硫酸氢钠对DNA处理不完全,也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR产物作进一步判断。

2. 性高效液相色谱法。

Oefner等提出变性高效液相层析(denaturing HPLC,DHPLC)用于单核苷酸和DNA分析。

邓大君等将该法改进并与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法,其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的DNA产物进行差异性扩增,由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留,因此在随后的PCR扩增时,其变性温度也相应上升,使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长,从而判定出PCR产物的DNA序列甲基化状况。

3. 合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。

联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法原理=先对样本DNA行亚硫酸氢钠处理后,PCR扩增目的片段,随后用限制性内切酶消化,此酶识别序列中需包含CG序列,如BstUI(CGCG)。

若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG),则PCR扩增后保留为CGCG,BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中,C未发生甲基化,则PCR后转变为TGTG,BstUI识别位点丢失,不能进行切割。

这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。Brena等联用COBRA和Agilent 2100 Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析,使COBRA的定量更快速,准确且无放射性污染。

该法的优点是:方法相对简单,不需预先知道CpG位点及样本序列;可进行甲基化水平的定量研究:需要样本量少,可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是:只能获得特殊酶切位点甲基化情况,因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能;由于酶和PCR的使用,序列分析受到限制。

4. 基化敏感的单核苷酸引物延伸法。

甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(Ms-SNuPE)可用于快速判断DNA片段中某些具体位点的甲基化状况。其原理:样本DNA经亚硫酸氢钠修饰,PCR扩增目的片段,产物电泳分离后作为Ms-SNuPE模板。分别针对所检测的CpG位点设计上游引物,使3’-端引物紧邻C。

然后将模板、引物、Taq酶及32p标记的dNTP混合,进行单核苷酸延伸反应。若所检测的CpG位点发生甲基化,则32p标记的C掺入到PCR产物中;反之,未甲基化掺入的则为T。再电泳分离产物,成像。根据某- CpG位点的C/T信号强度比,可定量其甲基化程度。

也可不经电泳,PCR产物直接转移到尼龙膜上,成像后即可得到所测多个CpG位点的平均甲基化程度。Ms-SNuPE可快速定量多个CpG位点的甲基化程度,但它不能对较长的序列进行全面的考察,且检测多个CpG位点时,需设计较多的引物。

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