oligo知识大总结

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最长听说的是Oligo(dT)，主要是由T(胸腺嘧啶）构成的核苷酸链，其次Oligo引物设计软件 ，由于其操作的简便性和引物分析设计的功能强大而风靡全球,Oligo芯片是微阵列的一种，又称寡核苷酸微阵列。

Oligo(dT)

定义

多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸 ，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。

应用

1.oligo(dT) capture

因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析 技术。

2.反转录(RT-PCR )

因绝大多数真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成 的cDNA比随机六聚体作为引物所得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。但是在反转录从mRNA获得cDNA时，也可以用随机六聚体引物和特异性引物。

随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

Oligo 6.22 使用技巧简介

1.功能

在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图;Oligo .22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。

2.使用(以Oligo 6.22 为例)

Oligo 6.22 的启动界面如下：

图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发6的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。

经过Windows/Tili 项后的显示如图：

在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左 下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选 取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低(如图：)

Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线 为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。

当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或 下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成(cross dimer)。

二聚体形成的能值 越高，越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。

当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构， 而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹 结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55%为宜。

有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游 引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基 因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。

这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。

如果引物在错配位点的引发效率比较 高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的 引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。

当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。

Oligo芯片

Oligo芯片是在cDNA芯片的基础上发展起来的。他通过预先设计并合成特性的寡核苷酸一般25-60mer长度，然后将其点样到特定的基质上构成芯片。他克服了由于探针杂交条件变化巨大导致的数据结果的不可靠。

但也存在点样时引物浓度不同引起的信号差异变化。由于Oligo芯片的探针是初期一次性合成，因此Oligo芯片需要合成的数量十分巨大才能使每片的成本摊薄。

事实上，由于每次芯片的使用很少，加上实验分析等消耗的时间，从实验初期到实验末期的时间跨度很大，因此早期合成的Oligo探针存在着降解而导致检测质量下降的情况，这样，除非重新合成新的探针，否则后期的芯片的检测质量会大大的降低。

同时，如果实验目标发生变动，则合成的探针无法继续使用，造成巨大的浪费。

推荐：oligo6.0是现在使用最广泛的引物和探针设计软件，值得一提的是它具有多重PCR引物设计和LCR反应探针设计的功能。