经过百年发展,LC-MS/MS越来越广泛应用于药物、食品、环境、法医、临床等各个领域。尤其在临床检测上适,用范围远远超过放射性免疫检测和化学检测范围,是其他方法无可比拟的。
LC-MS/MS具有灵敏度高,选择性强,准确性好等特点。那么,液质质到底比液质强大了多少倍?液质难道没有用武之地了吗?貌似也不太可能吧。。。
废话不多说,今天的重点是帮您搞定液质质的定量分析!
Hold不住,不要紧,照着这八步做,多做几次就差不多了,永远记住:孰能生巧!
第一步:Q1 SCAN——确定母离子的质荷比
根据待测化合物性质,选择分析的极性(+/-)、离子化方式(ESI/APCI),根据分子量选择扫描范围和时间
确定母离子的质荷比,准确到小数点后一位。
参数设置:
扫描方式:Q1 Scan;质量范围:Parameter Range,100~MW+30,t=1~2sec,Center Width,MW±5Da,t=0.5sec;通过手动调节DP、GS1,使喷雾平稳、有效。
第二步: Product Ion Scan —— 确定子离子的质荷比
得到高质量的MS2图,母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜
平滑后选择子离子质荷比,确定到小数点后一位
参数设置
扫描方式:Product Ion Scan;质量范围:Parameter Range,50~MW+10,t=1~2sec;
通过手动调节CE。
第三步: 优化化合物参数
根据前面选出的母、子离子,组建MRM离子对
选择多个离子对时,应合理分配每一对的分析时间
用“Ramp”,优化Compound项下各参数,以及Source项下CAD参数。各离子对应分别设定。
初步建立MRM方法
一般优化两次,以得到比较确切的结果
第四步: 方法转化:将连续进样方法→LC-MS方法
关掉所有质谱分析界面,将现有质谱体系灭活,激活液相色谱、质谱设备。
单击Acquire中Build Acquire Method,打开上面保存过的MRM方法,添加设备:色谱泵、自动进样器等。
设置色谱同步。
设置色谱参数,分析时间一般为0.6~1min,流动相组成和流量与实际样品分析时相同;修改质谱分析时间,与色谱参数一致;设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、400左右,保存方法,例如:LC-MRM.dam。
第五步:FIA-优化Source参数
将前面用过的样品溶液稀释100~1000倍。
在Tune项下,双击 Quantitative Optimization,选择FIA分析,
根据向导进行自动优化。 不接色谱柱进行FIA定量优化
注意:需要优化的各可选值之间用“;”分隔。
当对源参数含义及设置比较清楚后,可以省略此步。
第六步:色谱条件优化
接好并平衡色谱柱,用适当浓度标准品考察分离情况;
根据色谱分离情况,会设定梯度洗脱;
MRM方式可以不必所有峰都基线分离,但要注意避开;
基质离子抑制的干扰;
调整色谱流动相组成和流速,并相应调整源参数。
第七步:标准工作曲线的制作
空白基质添加标准品,稀释成不同浓度;
根据LC流动相组成,选择稀释液,配制实际样品;
编辑批处理文 件,排列进样顺序;
平衡MS离子源和色谱柱;
LC-MS/MS采集数据。
第八步:数据处理
标准曲线的制做、正确积分色谱图、有内标和无内标的计算方法。
图为重复步骤-流程图
要想熟练掌握“液质质”这些是必经之路!
查阅文献;
1 做好样品前处理,萃取 浓缩 分离 纯化;
2 有条件的可先在HPLC上摸好LC条件,能够基本分离更好,缓冲体系符合MS要求;
3 溶剂包括水的纯度,最好色谱纯以上;
4 新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非常容易;
5 吸附在进样阀和管路中,用溶剂清洗;
6 质谱仪须校准,预热时间要足够长,气流的稳定也很重要,液N;
7 气阀开度要注意,达到稳定程度。
8 MS条件优化—— 先定性后定量
9 LC条件优化
10 前处理方法的优化
11 数据处理