食品微生物检验之纸片法

　　摘要：纸片法在食品检测的实际应用中表现出操作简便、灵敏度高、速度快等特点，为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持。本文主要介绍了纸片法的原理和纸片法在食品中微生物检测中的方法应用以及与平板计数法进行了对比研究。 
　　前言： 
　　食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒，食品的检测与分析工作已经提高到一个极其重要的地位。特别是为了保证食品的标准品质，开展食品科学技术研究，寻找食品污染的根源，人们更需要对食品进行各种有效营养物质和对人体有害、有毒物质的检验和分析。自20世纪70年代起，各种食品检测不断出现，主要包生物化学技术、纸片法等，目前这些技术在食品检测和分析等方面已经得到了较好的应用，特别是纸片法。纸片法以其操作简便、灵敏度高、速度快等优势在食品检测领域得到愈来愈广泛的应用[1，2]。 
　　一、纸片法的原理 
　　纸片法，即以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定微生物的方法[3]。快速测试片法有以滤纸为载体的测试片，这种测试片是一种水合物干膜，由上下两层薄膜组成，上层是聚丙烯薄膜，下层是上印有网格的聚乙烯薄膜，通过一种冷水可溶性的凝胶剂附着在培养基上。培养基上有微生物生长所需的营养物质、特异性显色物质和抗生素。 
　　纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。 
　　二、纸片法的优、缺点及改进 
　　本文介绍的是北京陆桥公司研制的Easy TestTM纸片（简称ET），E T微生物测试纸片是一种将脱水培养基附着于无纺布棉垫上的即用型检测产品，利用了特异性酶与特异性显色底物反应的原理，使目标菌与非目标菌呈现可明显区别的不同特异性颜色，ET测试纸片的培养载体采用了无纺布和水溶性营养底物的设计，具有良好的吸水性，可快速吸收测试液，使微生物自动均匀分布于无纺布上，为测试液和营养底物创造了一个固定的混合区域。这种纸片法排除了滤纸测试片不易计数、营养物质分布不均、显色指示剂单一和保水性差的缺点，待测样品不需灭菌、本身带有培养基，样品可直接加入。其特点可归纳为：可应用于现行GB/T 4789-2008和SN标准中；使用方便，即用型产品，省去配制步骤，减少工作量；大量缩短检测时间，提高检测效率；降低对操作人员的技术要求；准确：灵敏度高、特异性强；可用于食品微生物检测和环境卫生检测，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数、金黄色葡萄球菌计数。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果[4]。 
　　从实用性来说，ET纸片省却了大量的玻璃器皿的麻烦，操作简便，携带方便，污染小；可在野外迅速检测所采集样本，避免常规方法因运输时间长而造成的菌落环境变化，更能反映采集样本真实菌落情况；培养后所长的为有色菌落，便于计数。 
　　纸片法也有其弊端，测试片较小，菌量数较大时计数困难；只研制出了少数几种类型的测试片，只能局限于几个指标的检测上。 
　　目前，对纸片法分改进主要是扩大被检测目标菌种种类；研制具有检测较大菌量的纸片，并且提高检测准确性。神保胜彦[5]（1991）对纸片法作了进一步研究和改进，改进后的纸片法不仅能够确定抗生素的种类，而且提高了检出率和准确性，氯霉素最低检出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，链霉素1mg/kg，红霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。 
　　三、纸片法在食品微生物检验中的应用[6] 
　　1.菌落总数测试片，揭起覆盖的胶片，将1ml样品悬液滴于纸片中央后盖回，用压板轻轻压下，将样品均匀地覆盖于培养基上。静置约1min使培养基中的凝胶固化。测试片水平放于37℃恒温箱内培养。细菌总数测试片培养48±3h后计数红色菌落数作为细菌总数，亦可用作乳酸菌测定。 
　　2.霉菌、酵母菌测试片，该测试片含霉菌酵母生长的营养物质、菌落生长的指示剂，并添加抗生素以抑制细菌生长。接种后，21℃～25℃培养3～5 d，计数。酵母菌菌落特征：小型菌落，边缘清晰，颜色均一，灰白色至蓝绿色，菌落隆起。霉菌菌落特征：大型菌落，边缘模糊，中间颜色深暗，颜色不均一，菌落扁平。 
　　3.大肠菌群、大肠杆菌检测纸片，该测试片含有改良的VRB（Violet Red Bile）培养基及葡萄糖苷酸酶指示剂。绝大多数大肠杆菌能产生β-葡萄糖苷酸酶，与培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围，表面覆盖的胶膜，可留住发酵乳糖产生的气体，形成蓝色和深蓝色的菌落并有气泡相连。大肠菌群菌落在测试片上产酸，pH指示剂使培养基变为暗红色，在红色菌落周围有气泡者为大肠菌群。所以，一次测试即可测出大肠杆菌和大肠菌群数：带气泡的蓝色和红色菌落为大肠菌群，带气泡的蓝色菌落为大肠杆菌。 
　　4.金黄色葡萄球菌测试片，该测试片含有改良的Baird Parker培养基，对于金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择性，并能将其鉴定出来，与3个Baird Parker平板加一个血浆凝固酶试管的方法等效。其可形成暗紫色菌落，如果在测试片上有其它可疑菌落出现，可以使用金黄色葡萄球菌确认反应片。其含有显色剂及脱氧核糖核酸，由于金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶，具有耐高温特性，高温处理后仍能将DNA降解而与反应片上的显色剂反应形成粉红色环。 　　5.沙门氏菌测试片，将选择性培养基中加入沙门氏菌特有辛酯酶的显色指示剂，并将其加载在纸片上，通过培养，如果样品中含有沙门氏菌，即可在纸片上呈紫红色的菌落。 
　　四、分别用纸片法和平板计数法检验食品中的大肠菌群 
　　1.检验之前的准备，检验之前的准备是保证检验高质量的前提，应做好以下几点： 
　　1.1为了保证微生物检验的高质量，要求检验人员的要有专业知识和熟练的技术，而且还必须具备对工作的高度责任感和实事求是的科学工作作风。确保实验室人员得到及时培训及不断更新知识，学习和掌握新理论、新技术和新方法。 
　　1.2 环境，实验室应具有进行微生物检验适宜充分的设施条件，包括检测设施（专用于微生物检测和相关活动）及辅助设施（大门、走廊、管理区、样品区、清洁间）特殊的设备要在特殊的环境下放置和操作。所用无菌实验室应符合GB19489[7]的规定。 
　　1.3 操作，操作人员必须严格按照GB/T 
　　4789[8]食品微生物检验标准中的操作规程进行检验，做好灭菌处理，为防止二次污染采取必要措施，原始记录要真实准确，不得随意填写。按照GB/T 4789标准规定的方法进行数据处理及结果判定。 
　　以严谨科学态度，做好上述几个环节准备工作，就能使我们微生物检验数据的准确性得以保证，为食品卫生和安全提供可靠技术保障。 
　　2.材料与试剂 
　　2.1 材料：培养箱、移液器、水浴锅等。 
　　2.2 试剂与培养基：北京陆桥大肠菌群ET测试纸片，培养基。 
　　2.3 茵株：大肠杆菌标准菌株一株，金黄色葡萄球菌标准菌株一株，实验室分离保存菌株两株（沙门氏菌和酵母菌）。 
　　2.4 样品：瓶装啤酒、冰点、休闲小食品、糕点、速冻食品、水产品、乳制品、熟肉制品等为本实验室日常抽检样品和委托检验样品，生肉类、熟制品、凉拌菜共十二类产品，每类10份样品，共120份样品。 
　　3.比较与实验方法 
　　3.1 方法比较：根据实际试验操作情况，将GB方法（平板计数法）[9]同ET测试纸片法进行对比，主要列举和分析计数原理、操作步骤、培养时间等。 
　　3.2 检测结果比较实验 
　　3.2.1 菌株加标实验：将大肠杆菌、沙门氏菌和酵母菌分别和干扰菌金黄色葡萄球菌一起加入各类食品样品中，每类加入3份，共36份样品。每份样品目标污染值约为1*10CFU/ML，每份样品均采用GB平板计数法VRBA法和北京陆桥大肠菌群测试纸片ET法同时检验。 
　　3.2.2 普通样品检测：将120份样品按照GB4789.3—2010处理，用平板计数法VRBA法和ET测试纸片法同时检验。 
　　3.2.3 结果分析：将加标实验的36个结果和普通样品检测中的阳性结果取对数，进行配对t检验，计算P值，研究两种方法间是否存在显著性差异[10]。 
　　4.结果与分析 
　　4.1 方法比较，针对GB4789. 3—平板计数VRBA法与ET测试法的比较见表1。 
　　4.2 菌株加标实验结果：加标的36个样品结果见表2。 
　　4.3 普通样品检测结果：十二类120个样品中，共检出59对阳性结果，具体结果见表3。 
　　4.4 通过配对t检验计算可知P值为0.16 > 0.05，可见两种方法检测结果无差异。 
　　4.5纸片法与平板计数法相比较，具有快速、简便、易于操作等特点[11]，平板计数法需要72h出结果，而纸片法只需24h就能报告检测结果，检测速度得到了很大的提高，更能满足现代食品进出口业务快进快出的要求，而且纸片法操作简便，省去了培养基配制、杀菌消毒、器皿洗涤等繁琐的劳作，有效提高了实验室的工作效率，但是测试片价格较贵，可先在专业食品检测实验室和经济效益较好的食品生产企业推广使用。 
　　五、结论 
　　尽管食品微生物的检测方法有很多种，但纸片法在食品检测的实际应用中表现出操作简便、灵敏度高、速度快等特点，已在食品领域的微生物检测中得到广泛应用。随着纸片法食品微生物检测技术的不但发展，相信纸片法会在食品微生物检测、监控等方面发挥愈来愈大的作用。 
　　参考文献： 
　　[1] 唐灵.郭奕芳.吴翊等.纸片法和国际法检测奶制品细菌总数和大肠菌群数的结果比较.2000. 
　　[2] 吴清平.周艳红.蔡芷荷.卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用[J].中国卫生检验杂志.2005. 
　　[3] 李洪.龚涛.达永淑.等.探讨影响大肠菌群快速纸片法的因素[J].职业卫生与病伤.2002. 
　　[4] 王芳.王凯.樊赟.刘沛.王磊.Easy Test（TM）测试片——微生物快速检测新产品.《食品安全导刊》.2010. 
　　[5] 神保胜彦.孟惠英.蜂蜜中残留四环素类和磺胺类药物的微生物简易检测法.《农业新技术新方法译丛》.1993. 
　　[6] 王会娟.王丽.路琳等.实验室常用的微生物快速检验技术.[J].肉类工业.2004. 
　　[7] 《实验室生物安全通用要求》.GB19489- 
　　2008. 
　　[8] 微生物检测标准.2010. 
　　[9] GB 4789.3-2010.食品安全国家标准.食品微生物学检验大肠菌群计数. 
　　[10] 郑建淮.陈晓燕.毛文军.复方醋酸环丙孕酮和罗格列酮序贯用药对氯米芬抵抗的多囊卵巢综合征患者内分泌及生育功能的影响.2005. 
　　[11] 林彩华.许如苏.曾梅锦等.SN标准和纸片法检测水产品卫生指标菌的比较.[J]中国卫生检验杂志. 2006.