一、光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反映混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度和透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测色度增长速度的方法。
光度测定试验应在特定的仪器中进行,温度一般为37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等,参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性,应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时,需进行标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素配成溶液,并制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不得大于10),最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法,每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照在设定的时间内不发生反应,将全部数据进行线性回归分析。
根据线性回归分析,标准曲线的相关系数(r)的绝对值应该大于或等于0.980,试验方为有效。否则须重新试验。
干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。每种溶液至少做2个平行管。
光度测定法干扰试验的制备
编号 | 内毒素浓度 | 配制内毒素的溶液 | 平行管数 |
A | 无 | 供试品溶液 | 不少于2个 |
B | 标准曲线的中点(或附近点)的浓度(设为λm) | 供试品溶液 | 不少于2个 |
C | 至少3个浓度(最低一点设定为λ) | 检查用水 | 每一浓度不少于2个 |
D | 无 | 检查用水 | 不少于2个 |
注 A:稀释倍数未超过MVD的供试品溶液。
B:加入标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的,且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。
C:如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的,用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
D:阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs,再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。
R=(CS-Ct)/λm×100%
当内毒素的回收率在50%~200%之间,则认为在此该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围时,须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。并要重复干扰试验来验证处理的有效性。
当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。
检查法
按“光度法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方为有效:
(1)系列溶液C的结果要符合 “标准曲线的可靠性试验”中的要求。
(2)用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后,计算出的内毒素的回收率要在50%-200%的范围内。
(3)溶液D在规定的时间内不发生反应。
若供试品溶液所在平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后,小于规定的内毒素限值,判供试品符合规定。若大于规定的内毒素限值,判供试品不符合规定。
(注:本检查法中,“管”的意思包括其他任何反应容器,如微孔板中的孔。)
注:2005年版中国药典中指出:细菌内毒素试验所用的器皿需经过处理,以除去可能存
在的外源性内毒素。常用的方法是在250°C干烤至少60分钟。也可采用其他确证
不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械,如微板孔和微量加样器配套
的吸头等,应选用标明无内毒素,并且对试验无干扰的器械,试验操作过程防止微
生物污染。
二、关于显色基质鲎试剂试验的一些问题
| 微板法(56 Test) |
能测样品数 (做平行管) | 需要做标准曲线:23个样本 不需做标准曲线:28个样本 |
每次需样品量 | 50 ul |
优缺点 | 96个孔同时操作,同时读数,效率与试管法相比可提高十倍以上,但该方法需要酶标仪(405nm滤光片) |
注意事项 | 为避免操作误差,每个样品均做2孔,再求其平均值 |
三、内毒素试验(内毒素定量检测)所需试剂及仪器
1.试剂(鲎试剂包括凝胶法——定性、显色基质法——定量、动态浊度法——定量)
名字 | 用途及说明 | 规格 |
鲎试剂 | 与内毒素反应,检测样品中内毒素用 | 10支/盒(凝胶法)、试剂盒(光度法) |
内毒素 | 与鲎试剂反应,做阳性对照,或烘箱验证 | 10支/盒 |
检查水 | 溶解鲎试剂用或稀释用 | 10支/盒(2ml、10ml)瓶(50ml) |
2.耗材
名字 | 用途及说明 | 规格 |
除热原吸头 | 稀释急加样。普通吸头会干扰试验,造成假阳性不能使用。 | 5支/小包 (200μl、250μl、1000μl) |
除热原试管 未除热原试管 | 稀释用或反应用容器 使用前需洗干净250度干烤1h | 6支/包 |
除热原空安瓿 | 稀释用或反应用容器 | 10支/盒 |
真空采血管 | 采血用 含抗凝剂 | 5ml |
除热原加样槽 | 加样用 (显色基质鲎试剂微板法用)配合8道移液器 | 3个/包 |
除热原微板 | 加样用(显色基质鲎试剂微板法用) | 个 |
除热原针筒 | 采样用 | 支 |
3.仪器
名字 | 用途及说明 | 规格 |
旋涡混合器 | 混匀内毒素溶液 |
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移液枪 | 加样 | 大龙(推荐)200-1000μl等各种规格 |
酶标仪 | 检测内毒素含量 (显色基质鲎试剂微板法用) | 北京普朗集团(DNM-9602G)型 (推荐) |
分光光度计 | 检测内毒素含量 (显色基质鲎试剂试管法用) | 可见光光度计 |
恒温水浴锅 | 保温、加热 |
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4.其他
名字 | 用途及说明 | 规格 |
G因子抑制剂 | 抑制G因子旁路反应 | 0.6ml/支 |
钙镁离子添加剂 | 阳离子调节剂 | 1ml/支 |
抗凝剂 | 血液样品使用 | 5ml/支 |
血液稀释剂 | 血液样品使用 | 5ml/支 |