美国麻省理工学院（MIT）的Picower研究所开发的新型三光子显微镜能够提供高速、低功率的超短光脉冲，能够到达大脑内的深层目标，而不会造成功能性干扰或物理损伤。它能够高效地检测由细胞发出的荧光，并产生具有清晰分辨率和快速帧速率的图像。三光子显微镜使科学家们能够更深入地观察大脑，因为较低能量、较高波长的光子比较高能量、较短波长的光子更不容易被细胞分子（如脂质）散射。
从视觉皮层（左侧的层1到右侧的底板）以2μm的增量采集的450个横向三光子图像序列的三维渲染。绿色代表GCaMP6s信号，品红色代表血管中产生的无标记THG信号和白质中的髓鞘纤维。图片来源：Murat Yildirim等。
研究人员对一台定制的三光子显微镜进行了优化，使用小于20毫瓦的平均激光功率对对清醒的小鼠大于1毫米深的大脑皮层的垂直柱进行成像。他们测量了生理反应和组织损伤阈值，以定义无损伤三光子成像的脉冲参数和安全限值。随着低能量水平的实现，科学家们开发了一种预啁啾系统来补偿显微镜中的脉冲展宽，并能够将样品上的脉冲宽度减小到40 fs。他们实施了一条延迟线，以提高脉冲重复率并提高帧速率，并在激发和发射路径中设计光学元件，以最大限度地提高显微镜的效率。
该研究团队开发了两种无标记方法来表征活体小鼠大脑的光学特性，并使用这些特性设计了一种独特的光学系统。在验证优化的三光子示波器的测量与双光子显微镜和电生理学的测量结果一致后，研究人员使用他们的显微镜观察清醒老鼠的所有深度超过1毫米的皮层中的神经活动，以观察细胞对标准视觉输入的反应。研究人员具有波前成形的双光子显微镜能够对平均激光功率小于10mW的标记皮质层神经元进行成像，平均激光功率小于20mW的亚平板神经元，平均功率比通过图像层5神经元所需的平均功率低近一个数量级。
研究人员观察到第5层神经元对多种方向的反应，比其他层中的细胞具有更多的自发活动，并且与更深部的大脑部分有更多的连接。第6层神经元的定向调整比其他层中的神经元稍微更清晰，这意味着它们对不同方向的响应更具特异性。亚板神经元位于皮质层6下方的白质中，并且首次由该团队表征，显示出低视觉响应性和宽的方向选择性。研究人员认为这一发现很有意义，因为许多科学家认为亚板神经元在发育过程中最活跃。
研究员Murat Yildirim表示：“我们想要展示我们能够用三光子显微镜技术对清醒状态下的动物做些什么，这样我们就可以提出神经科学中的重要问题，你可能认为你拥有世界上最好的显微镜，但在你问这些问题之前，你不知道你会得到什么结果。”Mriganka Sur教授表示：“通过优化光学设计和其他参数特征，使得我们能够在大脑中进行测量，实际上我们能够创造出以前无法实现的新发现。”
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