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PCR操作步骤及注意

2019.3.02
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zhaochenxu

致力于为分析测试行业奉献终身

  PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段,并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此,PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析,还可以用于突变体和重组体的构建,基因表达调控的研究,基因多态性的分析,遗传病和传染病的诊断,肿瘤机制的探索,法医鉴定等诸多方面。

  PCR操作步骤:

  1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix (2mM) 4 μl 引物1(10pM) 2 μl 引物2(10pM) 2 μl Taq酶 (2U/μl) 1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

  2. 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。

  3. 结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

  4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。

  PCR注意事项:

  1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。

  2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。

  3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。

  4.PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

  5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。

  6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

  7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。


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