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qPCR过程中有关RNA的问题

2019.3.02
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zhaochenxu

致力于为分析测试行业奉献终身

 


一、RNA 抽提注意点

!要避免RNase 污染

1需使用DEPC或高温高压处理耗材、器皿、试剂

2要求控制标本量:如组织:约40~100mg/ml TRIzol;

细胞:106~107细胞/ml TRIzol

3严格按照RNA抽提步骤进行,如戴手套、口罩操作实验

4如检测miRNA,必须含小分子RNA 

 

 二、RNA质量

 

 1、RNA检测---采用甲醛变性胶 

理论上28S:18S = 2.7:1 即为高质量的RNA

 2、分光光度法检测

 3、1.7 <A260 /A280 < 2.0------------基本无污染

         A260 /A280 <1.6------------蛋白或有机相污染

   解决:

   a.确保不要吸入中间层及有机相

   b.减少起始样品量,确保裂解完全

   c. 加氯仿重新再抽提、纯化

 4、A260 /A230 比值低-------试剂残留(乙醇)、多糖类污染

 解决:

    a. 加氯仿重新再抽提、纯化

    b. 风干RNA沉淀前去尽乙醇


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