由于突触连接的构成部分非常小（约数十纳米），通常借助电子显微镜来阐释神经元之间的突触连接模式（synaptic connectivity）。现有的大规模神经系统电镜重建数据（large-scale EM reconstruction of the nervous system）虽然可以用于构建无偏差的连接组，但是因为难以辨认神经元类群（neuronal population），导致这些数据通常不易解读【1-3】。因此要同时得知突触前神经元以及突触后神经元的所属群体通常需要多重标记（multiplexed labeling）。虽然电镜有非常高的空间分辨率（spatial resolution），然而传统的电镜成像方法并不提供任何光谱分辨率（spectral resolution），导致通过基因编码的（genetically encoded）多重标记仍然是困扰电镜领域的一个问题。近年来多个课题组采用了不同的方法来尝试解决这一个问题，但是这些方法都需要使用高度专业化的仪器设备【4-6】。因此开发一种通过基因编码，兼容大部分已有的仪器设备，并且可以用于单切片（single section）以及立体重建（volume reconstruction）的电镜多重标记方法，将会有助于了解神经突触连接。
2019年3月19日，哈佛大学医学院David D. Ginty研究团队（张祺屿为第一作者）在Nature Neuroscience发表了题为Multiplexed peroxidase-based electron microscopy labeling enables simultaneous visualization of multiple cell types的文章，报道了一种基于过氧化物酶、通过基因编码的电镜多重标记方法，并且展示了在小鼠的神经系统中如何使用这种方法来阐释突触连接模式。
该研究指出，传统的电镜成像方法虽然不能提供光谱分辨率，但是超高的空间分辨率使得分辨不同的细胞区室非常容易。因此如果使用过氧化物酶染色法在不同的神经元群体里标记不同的细胞区室，那么就可以在没有光谱分辨率的情况下实现多重标记。研究者首先基于斯坦福大学Alice Y. Ting研究团队开发的过氧化物酶APEX2【7】修改得到了二聚体dAPEX2，并展示了dAPEX2在表达于小鼠组织内时有更高的酶活性。研究者随后将dAPEX2以及HRP（辣根过氧化物酶）和不同的靶向肽（target peptide）组合成不同的融合蛋白以标记不同的细胞区室，并展示了这种方法可以明确地标记五种不同的细胞区室：细胞质，内质网，线粒体基质，线粒体膜间隙，和突触小泡（图1）。
图1 使用过氧化物酶标记的不同细胞区室。从左至右：（第一行）细胞质，内质网，线粒体基质，（第二行）线粒体膜间隙，突触小泡
利用重组酶系统Cre和Flp，研究者使用表达这些融合蛋白的AAV（腺相关病毒）标记了小鼠神经系统不同区域的两个或更多的神经元群体。研究者使用透射电镜观察这些组织的超薄切片，并确认了这些不同的标记可以被同时观察到并明确区分开，而且可以观察到这两个或多个神经元群体之间的突触连接（图2）。研究者进一步展示了在电镜图像中这些不同的标记也可以被明确地区分并用于神经元重建。最后，研究者展示了将这些融合蛋白敲入小鼠中可以获得可用的报告小鼠品系，进一步增强了这一方法的通用性。
图2 二重（左图及中图）及三重（右图）标记的神经组织切片
该研究提供了一种易于使用的通过基因编码的电镜多重标记方法，并展示了其在研究小鼠神经系统中的功用。由于与已有的仪器设备兼容，这种标记方法可以被以低廉的成本采用。研究者们希望这种方法可以帮助阐明已有的以及进行中的大规模电镜神经系统重建数据。该研究中报告的AAV表达质粒可从Addgene获取，报告小鼠品系则可从Jackson Laboratory获取（详情参见原文）。
据悉，哈佛大学医学院David D. Ginty教授、David L. Paul教授为本文共同通讯作者。哈佛大学博士生张祺屿为本文第一作者。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41593-019-0358-7
参考文献
1. Morgan, J.L., Berger, D.R., Wetzel, A.W. & Lichtman, J.W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell 165, 192-206 (2016).
2. Hildebrand, D.G.C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature 545, 345-349 (2017).
3. Zheng, Z., et al. A Complete Electron Microscopy Volume of the Brain of Adult Drosophila melanogaster. Cell 174, 730-743 e722 (2018).
4. Adams, S.R., et al. Multicolor Electron Microscopy for Simultaneous Visualization of Multiple Molecular Species. Cell Chem Biol 23, 1417-1427 (2016).
5. Drawitsch, F., Karimi, A., Boergens, K.M. & Helmstaedter, M. FluoEM, virtual labeling of axons in three-dimensional electron microscopy data for long-range connectomics. Elife 7 (2018).
6. Fang, T., et al. Nanobody immunostaining for correlated light and electron microscopy with preservation of ultrastructure. Nat Methods 15, 1029-1032 (2018).
7. Lam, S.S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods 12, 51-54 (2015).
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