用寡聚（dT）作引物合成放射性标记的扣除cDNA探针

反转录酶反转录酶缓冲液驱动方 mRNA模板 mRNA

乙酸铵DTTEDTA乙醇HCl异丁醇NaOH酚氯仿胎盘 RNA 酶抑制剂SDSSDS EDTA 溶液磷酸盐缓冲液SPS 缓冲液dNTP 溶液

沸水浴冰水浴矿物油Sephadex G-50 柱微量离心管水浴或加热板

一、材料

1. 缓冲液与溶液

乙酸铵（10 mol/L)

DTT (1 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

HCl ( 2.5 mol/L)

异丁醇

NaOH ( 3 mol/L)

酚：氯仿（1:1，V/V）

胎盘 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl）

SDS ( 10% m/V)

SDS/EDTA 溶液（30 mmol/L EDTA (pH 8.0)，1.2% SDS）

磷酸盐缓冲液（2 mol/L，pH 6.8）

SPS 缓冲液（0.12 mol/L（pH 6.8)，0.1% (m/V) SDS）

Tris-Cl ( 1 mol/L，pH 7.4)

2. 酶与缓冲液

反转录酶

10X 反转录酶缓冲液

3. 核酸与寡核苷酸

dCTP ( 125 μmol/L)

含 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液

驱动方 mRNA

oligo (dT)_12-18

模板 mRNA

4. 放射性化合物

[α-³²P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性为 >3000 Ci/mmol)

5. 专用设备

在 60℃ 下用羟基磷灰石层析分离单链和双链核酸的装置

沸水浴

冰水浴

矿物油，尖部拉长的可接到自动进样器上的吸头，或硅化的一次性 20 μl 玻璃毛细管、锉刀或钻石刀

Sephadex G-50 柱（5 ml)，用 TE ( pH 8.0）平衡

Sephadex G-50 离心柱，用含 0.1% SDS 的 TE ( pH 8.0）平衡

硅化的微量离心管（1.5 ml）

预热至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加热板

二、方法

1. 将 5~10 μg poIy(A)⁺ RNA 转移到一个灭菌的微量离心管，用无 RNA 酶的水将 poIy(A)⁺ RNA 的体积调至 40 μl。盖紧管盖，70℃ 加热 5 min，然后迅速将微量管移至冰水浴。

2. 向冷却的微量管中加入：

0.1 mol/L DTT                                      2.5 μl

胎盘 RNA 酶抑制剂                              200 单位

oligo (dT)_12-18                                      10 μl 

10X 反转录缓冲液                                25 μl

20 mmol/L dGTP、dATP、dTTP 溶液    10 μl

125 μmol/L dCTP                                 10 μl

10 mCi/ml [α-³²P] dCTP

( 比活性为 > 3000 Ci/mmol)                  100 μl

无 RNA 酶的水                                    加至 240 μl

反转录酶（2000 单位）                        10 μl

轻敲管外壁以混合各组分，微量离心机内稍加离心以收集管底的反应混合物，45℃ 下温育反应 1 h。

3. 加入以下试剂以终止反应：

0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)    10 μl

10% (m/V) SDS                10 μl

'混匀管中的试剂。

4. 向反应管中加入 30 μl 3 mol/L NaOH。于 68℃ 温育反应混合物 30 min 以水解 RNA。

5. 冷却反应混合物至室温，加入 100 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4) 中和溶液，混匀，然后加 30 μl 2.5 mol/L HCl。在 pH 纸上点一小滴（< 1 μl）溶液检测其 pH。

6. 用酚：氯仿抽提纯化 cDNA。

7. 用 TCA 沉淀法或 DE-81 滤膜结合法检测放射性标记的 dNTP 掺入的比例。按以下公式计算 cDNA 的产率：

在含 1.5 nmol 限量 dNTP 的反应中：



8. 通过 5 ml Sephadex G-50 柱层析分离放射性标记的探针与未掺人的 dNTP。

9. 在放射性标记的 cDNA 中，加入 10 倍重量的驱动方 RNA，用来扣除 cDNA 探针，并加入 0.2 体积的 10 mol/L 乙酸铵和 2.5 体积的冰冷乙醇。于 0℃ 放置 10~15 min，然后在微量离心机中以最大速度在 4℃ 下离心 5 min 回收核酸。

10. 吸去所有的乙醇，敞开管盖，置于试验台上使剩余的乙醇蒸发。将核酸溶于 6 μl 无 RNA 酶的水中。

11. 在溶解的核酸中加入：

2 mol/L 磷酸钠（pH 6.8)   2 μl

SDS/EDTA 溶液              2 μl

12. 用一滴轻矿物油覆盖于溶液上或将混合物吸入硅化的一次性 20 μl 玻璃毛细管，并在本生灯火焰上封住毛细管两端。

13. 将微量离心管或封口的毛细管放入沸水浴中 5 min，再移至 68℃ 水浴杂交，直至 Cr₀t = 1000 mol·s/L。



14. 从水浴中取出微量离心管或毛细管。用一个尖部拉长的吸头连到微量进样器上，从微量离心管中吸出杂交液，或用锉或钻石笔打开毛细管的一端，将杂交反应液转移到含有 1 ml SPS 缓冲液的管中。

15. 在 60℃ 下通过羟基磷灰石层析分离单链和双链核酸。

16. 合并含单链 cDNA 的各组分，用异丁醇反复抽提浓缩：加等量异丁醇，漩涡振荡混匀两相，室温下以最大速度在微量离心机中离心 2 min，弃上（有机）相。反复用异丁醇抽提，直到水相体积 <100 μl。

17. 通过以含 0.1% SDS 的 TE ( pH 8.0) 平衡的 Sephadex G-50 离心柱层析，去除 cDNA 中的盐。

18. 检测样品中的放射性量，计算扣除探针中 DNA 的重量。

19. 重复步骤 9~18。

10%~30% 的 cDNA 将在第二轮杂交中与驱动方 RNA 形成杂交体。