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关于cDNA文库的筛选鉴定的介绍

2022.10.11
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coco5517

认真做好每一件喜欢的事,把每一件要做的事都变成喜欢并认真去做的事

  1.核酸杂交

  是最常用,最可靠的方法之一,可大规模地分析文库的克隆子。

  1.同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列,常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆。

  2.部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同,常用于克隆家族基因。

  3.总cDNA探针:

  通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针。

  cDNA扣除探针:

  从第一种mRNA制备cDNA探针,连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;

  回收未杂交的cDNA探针,再与100倍过量的第一种mRNA杂交,使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集。

  * 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆。

  合成寡核苷酸探针

  2.特异性免疫学检测

  在cDNA表达文库中,目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测。

  3.cDNA克隆的同胞检测

  将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆。

  4.cDNA克隆的确证

  cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框。

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