1.核酸杂交
是最常用,最可靠的方法之一,可大规模地分析文库的克隆子。
1.同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列,常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆。
2.部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同,常用于克隆家族基因。
3.总cDNA探针:
通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针。
cDNA扣除探针:
从第一种mRNA制备cDNA探针,连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;
回收未杂交的cDNA探针,再与100倍过量的第一种mRNA杂交,使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集。
* 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆。
合成寡核苷酸探针
2.特异性免疫学检测
在cDNA表达文库中,目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测。
3.cDNA克隆的同胞检测
将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆。
4.cDNA克隆的确证
cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框。