用碱和SDS处理可以大规模的细菌培养物中分离质粒DNA,所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl- 溴化乙锭梯度离心进一步纯化。了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用;掌握质粒DNA分离和纯化的原理;学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法。
实验方法原理 | 这一方案科能是最常用的质粒制备方法,该法不仅相当决捷可靠,而且可获得相当纯净的粗制DNA。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 往2 ml 烧瓶中加入500 ml ,含有适当抗生素的LB培养基,然后加入5 ml 过夜培养的。 3. 于4℃,6 000 g 离心10 min,用4 ml GTE。
5. 加入1 ml 新配的含25 mg/ml 溶菌酶的GTE溶液,重悬沉淀,于室温放置10 min。
6. 加入10 ml 新配的NaOH/SDS溶液,并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠。于冰上放置10 min。
7. 加入7.5 ml 乙酸钾溶液,用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放置 10 min。
8. 于4℃,20 000 g 离心10 min 将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中,如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤。
11. 加入2 ml 70%乙酵轻轻洗涤沉淀,然后短暂快速离心,吸去乙醇,并真空干燥。
12. 沉淀可以在4℃无限期保存。 |