非同位素分析报道基因活性实验——萤火虫荧光素酶法

2019.3.26

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报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

实验材料	转染细胞
试剂、试剂盒	PBS 荧光素贮液 Triton 甘氨酰甘氨酸
仪器、耗材	橡胶细胞刮子绘图仪比色杯
实验步骤	1. 用冰冷的PBS洗涤在3个60 mm 培养皿中的转染了荧光素酶表达质粒的细胞各3次，毎次用4 ml PBS洗后吸去洗液。 2. 每个培养皿中加入350 μl Triton/甘氨酰甘氨酸裂解液。用橡皮刮子刮下细胞，将溶解的细胞转入1.5 ml 微量离心管中。4℃以最大速度微量离心5 min。将上清（细胞裂解液）转入一个干净的微量离心管中，置于冰上以备分析。 3. 在旋涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，取100 μl 置于发光计的比色杯中。加入360 μl 荧光素酶分析缓冲液。将比色杯放入发光计的杯箱中。 4. 用25 mmol/l ，pH7.8的甘氨酰甘氨酸稀释荧光素贮液至200 μmol/l。 5. 往发光计里的样品注入200 μl 稀释的荧光素溶液，25℃测量20 s 内的光输出量，减去仪器的背景（背景为比色杯中不加细胞裂解液时的光输出量测定值），以及比较每个样品的生物发光值与商品荧光素酶标准品的值而进行定量。

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