PBS 乙酸乙酯 氯仿 甲醇 Tris·Cl

薄层层析缸 滤纸 离心管 离心机

1.  100 mm 培养皿中的转染了CAT表达质粒的贴壁细胞，用PBS洗两次，每次5 ml每培养皿加入1 ml TEN溶液。将细胞置于冰浴5 min。

2.  用橡胶细胞刮子将细胞从培养皿上刮下来，将其转入一只1.5 ml 的微量离心管中，置于冰浴5 min。

3.  在4℃以最大离心速度离心细狍1 min，细胞沉淀重悬于100 μl 冰冷的0.25 mol/l 的pH7.5的Tris·Cl缓冲液中。

4.  在干冰/乙醇中冻结细胞5 min，移至37℃融解5 min。重复这种冻融过程两次以上。

5.  在冰上冷却细胞裂解液，然后，4℃以最大离心速度离心5 min。移出并保留上清（细胞提取物），置于- 20℃冻存。

6.  在下面混合液中分析20 μl 细胞提取液

2 μl  200 μCi/ml ［¹⁴C］氯霉素
20 μl  4 mmol/l 乙酰辅酶A
32.5 μl  1 mol/l Tris·Cl，pH7.5
75.5 μl  H₂O

7.  对于每组分析，在微量离心管中加130 μl 上述混含液和20 μl 提取液，轻轻混匀。 37℃温育1 h。

8.  加1 ml 乙酸乙酯至反应液中，在漩涡混合器上混匀。离心1 min，移出上层液相（乙酸乙酯）在Speedvac蒸发器中蒸干乙酸乙酯45 min。

9.  薄层层析缸的平衡：在缸中加入190 ml 氯仿，10 ml 甲醇，及一张与TLC薄层平板大小大致相等的Whatman 3MM 滤纸，静置2  h。

10.  将毎个样品重悬于30 μl 乙酸乙酯中，点样，在TLC薄板边缘之上约2 cm 处，每样5 μl。

11.  在盛有200 ml 19：1氯仿/甲醇的平衡过的层析缸中展开色谱，进行2 h 或至溶剂的前沿接近薄板的顶部为止。取下TLC薄板，在空气中晾干。用放射性墨水笔作上标记后，用塑料薄膜包裹，置于感光片上进行放射自显影。

12.  切出各显影点相应的薄层块放入闪烁液中计数，先测定出各单乙酰氯霉索的计数值所占的百分数而计算提取物的活性，按下列公式计算的活性：