通过杂交筛选未扩增的黏粒文库（滤膜影印）

2019.3.26

zhaochenxu

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经黏粒转化的稠密细菌菌落可通过杂交的方法筛选，该方法源于质粒转化菌落的大规模筛选（Hanahan and Meselon 1980)。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

实验方法原理	经黏粒转化的稠密细菌菌落可通过杂交的方法筛选，该方法源于质粒转化菌落的大规模筛选（Hanahan and Meselon 1980)。
实验步骤	一、材料 1. 培养基含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 琼脂平板（150 mm ) TB 培养基 2. 专用设备厚玻璃板皮下注射针头（17号）灭菌的硝酸纤维素膜或尼龙膜（137 mm) 灭菌的 Whatman 1 号滤纸 3. 载体与菌株 λ 噬菌体包装反应适合平板接种的大肠杆菌菌株（例如：XL1-BLUE, ED8767, NM554, DH5αMCR)。二、方法已包装到 λ 噬菌体颗粒中的黏粒 DNA 转化至大肠杆菌 1. 计算能产生 3 万~ 5 万个转化菌落的包装反应体积。 2. 准备数支灭菌的试管，试管中加有上述体积的包装反应产物和 0.2 ml 的接种细菌。 3. 37℃ 温育试管 20 min。 4. 在每支试管中加入 0.5 ml TB, 继续温育 45 min。 5. 将无菌滤膜平铺于 150 mm 的含有 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 琼脂平板表面（所需平板数与步骤 2 的试管数相等)。 6. 用一灭菌涂布棒将每支试管中的混合物均匀涂布在琼脂平板的滤膜上。当接种物被滤膜吸收后，将平板置于 37℃ 培养箱数小时或过夜（12~15 h)。 7. 将一张 137 mm 标有编号的无菌滤膜平铺于含 25 μg/ml 的新鲜 TB 琼脂平板上。 8. 将一张无菌的 Whatman 1 号滤纸平铺于厚的无菌的玻璃板上。 9. 用无菌平头镊子将影印滤膜从新鲜的 TB 琼脂平板（步骤7 ) 转移到 Whatman 1 号滤纸上。 10. 再用镊子将带有转化菌落的主滤膜从 TB 琼脂平板（步骤 6)上取下，菌落面朝下准确放到位于 Whatman 1 号滤纸上的带有编号的影印滤膜上。用另一张无菌 Whatman 1 号滤纸覆盖在两张滤膜之上。 11. 用第二块无菌厚玻璃平板将两张滤膜紧密的压在一起。 12. 移去上面的厚玻璃平板与 Whatman 1 号滤纸，用 17 号皮下针头沿每对硝酸纤维素膜或尼龙膜滤膜边缘不对称地打一系列小孔( 5 个左右已足够 ) 使两张滤膜相对定位。影印滤膜的生长 13. 剥离两张滤膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜滤膜)，迅速将它们重新平铺于各自的 TB 琼脂平板上（含 25 μg/ml 卡那霉素）。 14. 37℃ 温育主滤膜与影印滤膜数小时，直至细菌菌落直径至 0.5~1.0 mm。 15. 用 Parafilm 膜封好主平板，并倒置贮存于 4℃。 16. 裂解影印滤膜上的菌落，将滤膜与放射性标记探针杂交。彩印滤膜可用于再次复制文库，或贮存于 -70℃。

实验方法原理

经黏粒转化的稠密细菌菌落可通过杂交的方法筛选，该方法源于质粒转化菌落的大规模筛选（Hanahan and Meselon 1980)。

实验步骤

一、材料

1. 培养基

含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 琼脂平板（150 mm )

TB 培养基

2. 专用设备

厚玻璃板

皮下注射针头（17号）

灭菌的硝酸纤维素膜或尼龙膜（137 mm)

灭菌的 Whatman 1 号滤纸

3. 载体与菌株

λ 噬菌体包装反应

适合平板接种的大肠杆菌菌株（例如：XL1-BLUE, ED8767, NM554, DH5αMCR)。

二、方法

已包装到 λ 噬菌体颗粒中的黏粒 DNA 转化至大肠杆菌

1. 计算能产生 3 万~ 5 万个转化菌落的包装反应体积。

2. 准备数支灭菌的试管，试管中加有上述体积的包装反应产物和 0.2 ml 的接种细菌。

3. 37℃ 温育试管 20 min。

4. 在每支试管中加入 0.5 ml TB, 继续温育 45 min。

5. 将无菌滤膜平铺于 150 mm 的含有 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 琼脂平板表面（所需平板数与步骤 2 的试管数相等)。

6. 用一灭菌涂布棒将每支试管中的混合物均匀涂布在琼脂平板的滤膜上。当接种物被滤膜吸收后，将平板置于 37℃ 培养箱数小时或过夜（12~15 h)。

7. 将一张 137 mm 标有编号的无菌滤膜平铺于含 25 μg/ml 的新鲜 TB 琼脂平板上。

8. 将一张无菌的 Whatman 1 号滤纸平铺于厚的无菌的玻璃板上。

9. 用无菌平头镊子将影印滤膜从新鲜的 TB 琼脂平板（步骤7 ) 转移到 Whatman 1 号滤纸上。

10. 再用镊子将带有转化菌落的主滤膜从 TB 琼脂平板（步骤 6)上取下，菌落面朝下准确放到位于 Whatman 1 号滤纸上的带有编号的影印滤膜上。用另一张无菌 Whatman 1 号滤纸覆盖在两张滤膜之上。

11. 用第二块无菌厚玻璃平板将两张滤膜紧密的压在一起。

12. 移去上面的厚玻璃平板与 Whatman 1 号滤纸，用 17 号皮下针头沿每对硝酸纤维素膜或尼龙膜滤膜边缘不对称地打一系列小孔( 5 个左右已足够 ) 使两张滤膜相对定位。

影印滤膜的生长

13. 剥离两张滤膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜滤膜)，迅速将它们重新平铺于各自的 TB 琼脂平板上（含 25 μg/ml 卡那霉素）。

14. 37℃ 温育主滤膜与影印滤膜数小时，直至细菌菌落直径至 0.5~1.0 mm。

15. 用 Parafilm 膜封好主平板，并倒置贮存于 4℃。

16. 裂解影印滤膜上的菌落，将滤膜与放射性标记探针杂交。

彩印滤膜可用于再次复制文库，或贮存于 -70℃。