cDNA宏阵列方法分离拟南芥的臭氧应答基因实验(二)

1.所有的试剂必须用电阻高于 17. 6 的双蒸水配制。

2.提取 RNA 所用的玻璃器具必须于 180°C 烘烤至少 8 h 以灭活 RNase。除缓冲液外的所有溶液都要用 0 •1 % DEPC水 配 制（见注释 3)。 RNase 的污染主要来源于实验人员的手，所以进行 RN A 实验时需要戴一次性手套。

3.DEPC 可与胺迅速反应，所以不能用来配制含有缓冲成分的溶液，比如 Tris 等。可用新鲜启封的 Tris 结晶物制备无 RNase 的溶液。

4.DEPC 可能致癌，应小心使用。 .

5.R N A 的浓度可以通过取部分终产物测 OD26。确定。 OD26 q 为 1 的溶液中含 RNA约 45 / ig/mL。

6.甲基化的 dCTP (5'-methyl dCTP) 代 替 dCTP 进 行 cDNA的第一链合成反应，防止片段内的 XAo I 位点被酶切 

7.由于睡菌体Fl 的 gene II 内切酶（M13 gpH protein; LifeTechnologies) 已经不再生产，可 以 用 位 点 特 异 性 的 内 切 酶 N.BstT9 (BIORON GmbH, Ludwigshafen, Germany) 代替。反应体系为 5 pg 质粒 DNA， 20 U N.BstT9 和N.BstT9 缓 冲 液 [BI0 R0 N GmbH, 10 mmol/L Tris-HCl， pH 8. 5, 10 mmol/L
MgCl2， 150 mmol/L KC1， I minol/L DTT， 0 •I mg/mL 牛血清白蛋白（BSA)]混合，加水调整体积至 50 ^ xL, 于 55°C反 应 30 min。

8.挑选出的克隆数量取决于基因组大小和（或）实验目的。如果要制备一套好的拟南芥 cDNA (拟南芥全基因组大小约为1. 25 XIO8 bp), 就必须要在均一化的cDNA文 库（cDNA的平均长度约为 2kb) 中挑选不少于 3 X 106 个克隆。总体上，要得到一套较好的cDNA —般需要挑选 5 倍于基因组大小的克隆。

9.当比较多套基因表达数据时，宏阵列所用的膜经常要重复使用。用 1 % SDS 煮膜 30 min 能够有效地洗脱。由于这种方法对膜的物理损伤和膜上 cDNA 量的损失 ，膜的重复使用不得超过 5 次。 Homgerg 等采用了一种较为温和的方法(I6)。由于较短的cDNA 链解链温度也相对较低，经过氧化降解后，用他们的方法可以在相对低一些的温度洗脱，这样就可以减少温度引起的损伤。根据他们文中所述，同样的膜用这个方法即使重复洗脱 10 次也检测不出损失。

10.宏阵列膜的杂交效率受探针精确度、 R N A 质量和膜反复使用的次数影响。用高质量的 R N A 和新的膜及 3. 3 所述杂交体系就可以很好地完成实验。但是当信号强度较弱或者膜用作其他用途时，建议膜的洗脱温度应低于 65°C 。例如，当以拟南芥 d D N A 文 库制备的 c D N A 宏阵列用于检测其他物种，比如芥菜(Brasska na 外《) 或 小 麦（数据未发表）的基因表达谱时，建议洗脱温度应低于 42°C 。相反，如果所有点的信号强度都很强，则可提髙温度再洗一次。

11.在 3 中，我们提出用全局均一化法来均一化阵列信号，但最近刚刚发表了一种更精确的方法（lognormal distribution fitting method) 来评估数据质量和均一化（17）。