(1)样品制备和标记 为了获得目的基因的杂交信号必须对目的基因进行标记,由于目前常用的荧光检测系统的灵敏度还不够高,为了提高检测灵敏度,需要在对样品核酸进行荧光标记时,对目的基因进行扩增。生物样品成分复杂,往往含有较多的抑制物,在对样品进行扩增、荧光标记之前,必须先提取、纯化样品核酸。目前普遍采用的荧光标记方法有体外转录(NASBA),PCR,逆转录(RT)等。
(2)杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行杂交产生一系列信息的过程。在合适的反应条件下,靶基因与芯片上的探针进行碱基互补形成稳定的双链,未杂交的其他核酸分子随后被洗去(如果用实时荧光检测可省去此步)。杂交条件的选择与研究目的有关,基因的差异性表达检测需要长的杂交时间、高严谨性、高样品浓度和较低温度,这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。在进行突变体检测和单核苷酸多态性(SNP)分析时,要鉴别出单碱基错配,需要更高的杂交严谨性和更短的时间。此外,杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针 GC 含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度、待检基因的二级结构等因素。
(3)信号检测和结果分析 当前主要的检测手段是荧光法和激光共聚焦显微扫描。在杂交反应完成后,将芯片插入扫描仪中,对片基进行激光共聚焦显微扫描,样品核酸上标记的荧光分子受激发出荧光,用带滤光片镜头采集每一点的荧光,经光电倍增管(PMT)或电荷偶合元件(CCD)转换为电信号,计算机软件将电信号转换为数值,并同时将数值的大小用不同颜色在屏幕上直观地表示出来。
荧光分子对激发光、光电倍增管或电荷偶合元件都具有良好的线性响应,所得的杂交信号值与样品中靶分子的含量有一定的线性关系。由于芯片上每个探针的序列和位置是已知的,对每个探针的杂交信号值进行比较分析,最后得到样品核酸中基因结构和数量的信息。
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