3.3 核转录分析

PBSNP-40 裂解缓：20XSSCLNaOH甘油储存缓冲液10X 转录缓冲液核苷酸:ATPGTPCTP200uCi「α32P]-UTP10XSET蛋占酶 K无 RNase 的 DNaseCaCI2硫氰酸胍溶液Tris-SDS 缓冲液水饱和酚氯仿异戊醇无水乙醇异丙醇乙酸钠

紫外交联仪 D狭缝印迹装杂交箱

一材料与设备

1)cDNA

2)PBS

3)NP-40 裂解缓：0.5%NP-40,10mmol/LTris-HCl(pH7.4)，3 mmol/LMgCl₂,10 mmol/LNaCl

4)20XSSC:3mol/LNaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠 (pH7)。

5)1mol/LNaOH

6) 甘油储存缓冲液：40% 甘油，50 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 0.5 mmol/L MgCl₂, 0.lmmol/L EDTA

7)10X 转录缓冲液：l00 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，50 mmoI/LMgCl₂，800 mmol/LKCllmmol/LEDTA,5 mmol/LDTT

8) 核苷酸:ATP,GTP，CTP

9)200uCi「α³²P]-UTP:3000Ci/nmol。

10)10XSET;5%SDS，50 mmol/LEDTA，50 mmol/LTris-HCl(pH7,4)

11) 蛋占酶 K

12) 无 RNase 的 DNase:1Omg/mL

13)CaCI₂：20 mmol/L

14) 硫氰酸胍溶液:4mol/L 硫氰酸胍，25 mmol/h 柠檬酸钠 (PH7.0),0.5%Sa    rcosyl0.lmol/L2-疏基乙醇

15)Tris-SDS 缓冲液：Tris-HCl(PH7.2),1 mmol/LEDTA,0.1%SDS

16) 水饱和酚

17) 氯仿：异戊醇 (49:1)

18)0.45um 硝酸纤维素/尼龙膜，

19) 无水乙醇。

20) 异丙醇。

21) 酵母 tRNA:10 mg/ml。

22) 乙酸钠：2mol/L

23) 紫外交联仪 D

24) 狭缝印迹装

25) 杂交箱。


二、操作方法


下面每一步均在 0-4°C 进行

1）用冷的 PBS 洗 1X10⁷-5X10⁷ 个细胞，1500 g 离心 5 min 收集细胞。

2) 去除上清，重悬细胞于 PBS 中，1500 g 离心 5 min 收集细胞。

3) 去除上清，加入 4 mlNP-40 裂解液，温和涡漩振荡, 冰上放置 10 min

4) 于 4℃,400 g 离心 10 min 沉淀细胞核。用 NP-40 裂解液洗涤一次.

5) 用 200ul 甘油缓冲液重悬沉淀，在显微镜下观察细胞裂解情况。

6) 分装，冻存于液氮中。

(二）核转录

1) 在无菌离心管中加入：3X107 个细胞核，35% 甘油，20ul1OX 转录缓冲液，4 mmol/LATP，GTP，CTP,200uCi(α³²P]-UTP, 加蒸馏水至 200ul 于 26°C 温育 10 min

2) 加入 10ul_DNase1，10ul20 mmol/LCaCl₂，于 26℃ 温育 lOmin，酶切核 DNA。

3) 加入 2ul 蛋白酶 K,25ul10×SET,5ul 酵母 tRNA，于 37℃ 温育 30 min。

4) 加入 550ul 硫氰酸胍溶液，90ul2mol/LNaAc，900ull 水饱和酚，180ul 氯仿/异戊醇，置于冰上 15 min。

5) 于 4℃,12000 g 离心 15 mm, 吸出水相。

6) 加入等体积异丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h。

7) 于 4℃12000 g 离心 15mim 用 300ul  硫氰酸胍溶液溶解沉淀，

8) 加入等体积异丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h,

9) 与 4℃12OOOg 离心 15mim, 用 70% 乙醇洗涤沉淀，用 1 mlTris-SDS 缓冲液溶解沉淀。总活性为 1X10⁷-2X10⁷cpm。

(三) 杂交分析

1) 在 100ul 的 25ug cDNA 探针或 50ug 线性质粒中加入 10% 体积的 lmol/LNaOH，使之变性。

2) 温育 15 min, 用 10 倍体积 6XSSC 中和。

3) 剪裁大小合适的硝酸纤维素/尼龙膜。用 0.4mol/LTris(PH7.0) 溶液将膜浸泡30 min, 而后将膜置于狭缝印迹装置上。

4) 将 1-5ug DNA 加至膜上，真空状态下于 80℃ 烘烤 2 h 或紫外交联 2 min。

5) 按常规方法进行预杂交，杂交。

6)X 射线片，显影分析。

1) 洗膜的时间可根据实验确定. 上要考虑使用的探针的性质和力求莸得最小背景。

2) 细胞核的质量是核失控转录测定的关键。Dounce 匀浆器有助于制备不易被 NP40 裂解的细胞的核。