核酶实验——发夹型核酶实验

终止缓冲液

聚丙烯酰胺凝胶电泳装置放射自显影用具水浴

一、材料与设备

1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。

2. 放射自显影用具。

3. 水浴。

4. 终止缓冲液：90% 去离子甲酰胺，0.02% 溴酚蓝，15 mmol/L EDTA，50 mmmol/L HEPES-NaOH (pH 7.5)，0.1 mmol/L EDTA，12 mmol/L MgCl₂。

二、操作方法

1. 发夹型核酶的结构

发夹型核酶剪切与连接活性的基本结构是核酶中区域 A 和 区域 B 的直接相互作用，每个区域主要由进化上保守的内环与两侧的短双链螺旋构成。核酶的基本结构及其切割位点如图。



现在的研究所发现的具有催化活性的发夹型核酶最小的基序为 50 nt，因此可以用固相合成的方法获得发夹型核酶，也可以将修饰的 rNTP 导入核酶以增加其稳定性。

2. 催化反应实验

(1) 反式剪切实验。剪切反应可以从加入特异的阳离子形成底物-核酶复合体开始并从加入变性剂终止反应而结束；也可以通过把底物加入核酶中来启动反应，此时所有 RNA 均先在折叠终离了浓度下预孵育。

典型的剪切反应步骤如下：

① 准备 RNA 溶液。终浓度分別为核酶 0.5 μmol/L、³²P 标记的底物 RNA (1~2 nmol/L)，50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5、0.1 mmol/L EDTA。

② 准备阳离子溶液。终浓度分別为 50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5、12 mmol/L MgCl₂。

③ 上述两种溶液先在 25℃ 平衡 5 min，再将两溶液各取 40 μl 混合以启动反应。

④ 在 7~12 h 每个时间点取出 3 μl，加入 10 μl 终止缓冲液在冰浴中终止反应。

⑤ 20% PAGE-8 mol/L 尿素胶电泳，放射自显影。

(2) 连接实验。发夹型核酶可以连接带有 5'-OH 和 2'，3'-环化磷酸末端的 RNA。带有 5'-OH 未端的 RNA 可以由化学合成或通过转录产物的去磷酸化得到。而带有 2'，3'-环化磷酸未端的 RNA 仅能通过对发夹型核酶切割的底物跑胶分离后再切胶回收而得到。

连接实验方法与剪切实验方法一致，需要注意的是要保证核酶被剪切产物所饱和。