实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 在干净的1.5 mm 内径的凝胶柱管上作好标记以指示应灌制凝胶柱的髙度。用橡皮筋将凝胶柱管捆绑成束,在一水平面上垂直竖起管束,从其顶部向下推压,使各柱管的底部平齐。
4. 加8.25 g 尿素、6.0 ml 水、2.0 ml 30%丙烯酰胺/1.8%亚甲双丙烯酰胺、0.75 ml pH4~8的Ampholytes 两性电解质于一个小的真空瓶中。瓶内加一小搅棒,将瓶子置于磁力搅拌器的温水浴中,搅拌至尿素全溶于水,不要加热使溶液温度超过30℃。
5. 在强真空下脱气2~3 min,加入0.3 ml NP-40,摇晃使之溶解混匀。
8. 取去凝胶灌制管底部的Parafilm膜从底部将含有聚合好凝胶的凝胶管推出,用单刃刀片切去管子底部多余的丙烯酰胺。并在流动的去离子水下冲洗,除去残余的丙烯酰胺。
10. 将凝胶管连同扣眼安装在上缓冲液槽的孔眼中,多余的孔眼用橡皮塞子堵紧。
11. 往下缓冲液槽加入大约3 L 0.085%的磷酸。
12. 将上、下缓冲液槽安放在一起,调整下缓冲液槽使液面盖没凝胶。
13. 上缓冲液槽加入250 ml 0.02 mol/l 的NaOH,用带22G皮下针头的1 ml注射器将凝胶管的顶部用0.02 mol/l 的NaOH充满,小心排去凝胶管中的所有气泡。
15. 用50 ml 注射器将10~30 ul 蛋白质样品穿过凝胶管上的缓冲液直接加在凝胶的表面。
16. 盖上上槽盖后,连接电源。打开电源调到设定电压,恒压电泳16 h。
17. 将电压调到零位,关闭电源,结束电泳。用50 ul 注射器往毎根凝胶的顶部加入约1 ul 浓溴酚蓝溶液。
18. 用一个装上了 200 ul 移液器的吸头的注射器,将凝胶用水压从凝胶管中挤出。 |