用 PBSN 稀释特异性抗体或免疫球蛋白,配制包被抗体溶液(最终浓度 0.2〜10ug/ ml)。
采用十字交叉连续稀释分析法,确定待检测抗原浓度所需的包被抗体和酶-抗体结合 物的浓度(见辅助方案),用 PBSN 配制此浓度的包被抗体溶液。
用 50ul 包被抗体溶液包被 Immulon 滴定板,并封闭(见基本方案,步骤 3〜5)。
用封闭缓冲液按 1:3 (WV) 连续稀释(见辅助方案)同源抗原,配制标准抗原的 系列稀释溶液。使用结合动态范围大(15%〜85%,总范围是 0.1〜1OOOng 抗原/ml) 的稀释液。
虽然标准曲线对于精确测定待测样品中抗原量是必要的,但不需要用于定性检测。
用封闭缓冲液配制待测抗原溶液的系列稀释度(通常是 1〜1OOng 抗原/ml)。如需 要,测定待测抗原溶液 1〜2 个系列稀释度,确保至少一个稀释度可以精确测定。
抗体包被孔中加入待测抗原溶液或标准抗原稀释液(步骤 4),室温下孵育 2 h 以上。做 2 或 3 个复孔确保可精确定性测量,快速加入样品以最大限度减少因孵育 时间不同造成的误差。
洗涤滴定板(见基本方案,步骤 7),加入 50ul 碱性磷酸酶标记的特异性抗体(通常是 25〜400ng 特异抗体/ml),室温下孵育 2 h。
洗涤滴定板,每孔中加人 75ul MUP 或 NPP 底物溶液,室温下孵育 1h,用微量滴定 板检测仪检测。如显色反应水平低,应在显色后数小时重新检测滴定板。
绘制基于标准抗原溶液连续稀释数据的标准曲线。抗原浓度对数值为 X 轴,荧光度 或吸光度为^轴。用内插法,在标准曲线中求出待测溶液中抗原浓度。