酶联免疫吸附试验——抗体检测实验 (ELISA 试验)7

一、附加材料（其他材料见基本方案）

1. 未混合的细胞样品

2. 碱性磷酸酶标记抗体或 F（ab’）（从免疫动物中获得的抗免疫球蛋白抗体）

3. 阳性对照抗体（即与实验细胞反应的从免疫动物中获得的抗体）

4. 阴性对照抗体（即不与实验细胞反应的抗体）

5. 冰冷的洗涤缓冲液

6. 锥底或圆底微量滴定板

二、实验方法

1. 用阳性和阴性对照抗体替换待测抗体，全细胞替换包被液，十字交叉连续稀释分析 法确定每孔需添加的最适细胞数和碱性磷酸酶标记抗体或 F Ub^2 的浓度（见辅助 方案）。初始滴定时每孔加入 1X1O^5〜5X10^5 个细胞、0. 1〜10ug/ml 阳性和阴性对 照抗体、0.1〜10ug/ml 酶标抗体。

预试验中仅加入底物孵育，检测待测细胞本身是否表达碱性磷酸酶。如果表达 量较大，影响酶标抗体的检测敏感性，则用另一种酶标记复合物，如 P-半乳糖苷酶。

1. 使用台式离心机，将细胞样品加入 15 ml 或 50 ml 离心管，4°C，450 g 离心 5 min。计数细胞量（附录 3A），并用冰冷的洗涤缓冲液重新将细胞混勻，配制成 1X 1O^6〜5 X 1O^6 个细胞/ml。

2. 将 1OOul 细胞悬液（1X1O^5〜5X10^5 个细胞）加入锥底或圆底微量滴定板孔中， 4°C，450 g 离心 lm1n。真空吸去上清液，微量滴定板置于振荡器或微量滴定板摇床 上，悬浮沉淀物。

3. 用 1OOul 待测抗体或对照抗体（1〜10ug/ml），在冰冷的洗涤缓冲液中重新混匀沉淀 物。4°C 下孵育 1.5 h，每隔 15m1n 柔和摇动微量板重新混匀细胞。注意不要使细胞 悬液溅出孔板。

4. 4°C，450 g 离心细胞 1 min，真空吸去上清液，振荡悬浮沉淀物，加入 200jul 冰冷的 洗涤缓冲液重新将其混匀，重复 2 次。

5. 取 1OOm1 酶标抗体或酶标 F（ab’）2（细胞表达 Fc 受体时用），用冰冷的洗涤缓冲液 稀释到最适抗体浓度（通常是 100〜500ng/ml）重新混匀沉淀物。4°C 下孵育 1.5 h， 每隔 15m1n 柔和摇动微量滴定板重新使细胞混勻。

6. 按步骤 5 洗涤细胞，重复 3 次。

7. 加入 100ul MUP 或 NPP 底物溶液，进行显色，直至信号达到预想水平；显色过程 中，每隔 15m1n 柔和摇动微量滴定板重新使细胞混匀。如需要，加入 25ul 0.5mol/L NaOH 终止显色。目测或用分光光度计定量检测确定显色程度（见基本方案，步骤 9）。