方案3 用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解实验
| 实验方法原理 | 去垢剂裂解细胞法通常用于培养的动物细胞。典型的离子型去垢剂SDS(如2%SDS)能充分地裂解细胞。培养的动物细胞和细菌，如可以使用这种方式裂解。假如实验所用的抗体识别的抗原决定簇取决于自然空间构象，并对还原环境敏感，那么在裂解缓冲液中应除去二硫苏糖醇，并建议使用非还原/无脲的凝胶（Ji，et al，1997;Ji and Simpson,1999)。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1.将1X107~5X107个细胞加到1ml含有100 mmol/L DDT的Laemmli样品缓冲液中。 2.由于DNA的释放，在Laemmli缓冲液中细胞裂解液变得很黏，克服黏性问题有2种方法： (1)离心裂解液lOOOOOg，20 min，除去DNA; (2)超声破碎裂解细胞，每次超声15?30s，共4次，每次之间将样品在冰上放置15s。 3.在95°C水浴加热样品5 min。 4.20000 g离心5 min。 5.转移上清到一个新管中。 6.样品（上清）现在可以用于电泳（见方案1)和免疫印迹（见HarlowandLane，1999)。在免疫印迹研究中，制备培养细胞提取物时，蛋白样品必须满足以下条件： （1）溶于适合凝胶电泳系统的溶液中（如，溶液的pH值应该在7.0左右，并且盐浓度为200 mmol/L左右）； （2）蛋白浓度不能超过特定凝胶系统的承载能力（凝胶电泳变量的讨论见第2章）。对于传统凝胶，小胶的每个泳道的上样量不能>150ug 的总蛋白。 展开 |
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