方案13 胶内蛋白质的酶解和肽段提取实验

胶内胰酶消化缓冲液三氟乙酸（TFA)

冷冻干燥离心机小离心管水浴锅

1.切下凝胶上的蛋白质点，放人小离心管中。

2.以 0.lmol/L NH4HCO3、50% 乙腈（用于胰酶）或 0.05mol/L Tris-HCl(PH9.3)、50% 乙腈（用于 Lys-Q 各 1 ml，清洗凝胶 2 次，以去除多余的考马斯亮蓝染液。

3.离心冷冻干燥，使每一片凝胶完全干燥。当完全干燥时，每一片凝胶应不会粘到离心管壁上。

4.加入 10ul 的含有 0.5ug 适当蛋白酶的消化缓冲液，直接倾到干燥的凝胶片上，使其重新湿润。

5.静候 10~20 min，直到溶液完全被凝胶吸收。

6.如果需要，重复步骤④和步骤⑤，使凝胶充分膨胀。

7.加入 200 沁消化缓冲液，彻底覆盖凝胶片。

8.35°C 孵育 16 h。

9.小心倾出消化缓冲液（现在应称其为抽提液），注人一个干净的小离心管中。

消化缓冲液中含有超过 80% 的可提取肽段。

10.凝胶片中加入 200ul 0.1% TFA、60% 乙腈。

11.把含有凝胶片的小离心管室温孵育 30 min。

12.仔细吸取抽提液，与步骤⑨得到的抽提液混合起来。

13.通过冷冻干燥作用，减少抽提液的体积。不要彻底干燥提体液，否则会造成样品损失。

这一步的目的是去掉抽提液中的乙腈，以减小后面稀释并注射到毛细管 RP-HPLC 系统中的样品体积