方案17 原位 SDS-PAGE 肽谱作图方法（Cleveland法）

化学切割剂考马斯亮蓝含1mol L Tris-Cl 的乙醇聚丙烯酰胺平板凝胶蛋白酶消化缓冲液蛋白酶溶液

白光盒和手术刀聚丙烯试管平板凝胶电泳仪SpeedVac 浓缩器

方法 1: 酶催化的蛋白质片段化

1.固定聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质，用考马斯亮蓝染色（5~lOmin)，然后脱色。

如果蛋白质条带太浅，重复染色和脱色的步骤，或延长染色时间。

2.将凝胶放入透明的盒子中，用手术刀切下蛋白质条带，把条带分别放入聚丙烯试管中。

3.用 10 ml 含有 1 mol/L Tris-Cl 的乙醇，浸泡切下来的含有对照蛋白点的凝胶条带，室温 30 min，使凝胶收缩。

这一步有助于切下来的胶进入第二块平板胶。如果肽谱作图时着色太浅，应缩短浸泡时间。

4.将凝胶带切成碎片，把它们放到第二块平板胶的不同的上样孔中，第二块凝胶应是长的（5 cm) 浓缩胶。用干净的匙引导碎片落到孔的底部。

5.在碎片胶的周围，用注射器注射蛋白酶消化缓冲液。

6.在每个样品上方覆盖 10ul 的蛋白酶溶液。

用足够的蛋白酶以完成消化。最初试着用酶：底物为 1:50 的比例。

7.电泳，直到溴酚蓝到达浓缩胶的底部。

8.关掉电源 20~30 min，使蛋白酶消化蛋白样品。

9.继续电泳，直到溴酚荜到达平板胶的底部。

10.用考马斯亮蓝染色或银染（见方案 9 或方案 11)，使蛋白质显色；或用放射自显影术或荧光摄影术检测放射性标记的蛋白质。

方法 2: 化学方法使蛋白质片段化

1.固定凝胶，考马斯亮蓝染色（5~10min)，然后脱色。

如果蛋白条带太浅，重复染色和脱色的步骤，或延长染色时间。

2.将凝胶放人透明的盒子中，用手术刀切下蛋白质条带，把条带分别放人 1.5 ml 聚丙烯试管中。

3.用 SpeedVac 浓缩器（或其他设备，如吹风机）使切下来的凝胶干燥。

4.加入约 10ul 化学断裂试剂（1mg/ml)，直接倒在干燥的凝胶片上，再加入 90W 断裂试剂。

5.将混合物孵育一定的时间（关于孵育条件，见方案 6、方案 7 或方案 8)。

6.仔细吸出含有肽段的上清液。

7.用 SpeedVac 干燥样品，加入 50ul 水，再次干燥样品。

8.重复水洗和干燥过程，2 次。

9.加入 10~30ul SDS-PAGE 上样缓冲液，煮沸样品 5 min。

10.把上述样品加到 SDS-PAGE 凝胶中，电泳，直到溴酚蓝到达平板胶的底部。

11.用考马斯亮蓝染色或银染（见方案 9 或方案 11)，使蛋白质显现。或者，用放射自显影术或荧光摄影术检测放射性标记的蛋白质。