血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、用样量少和分辨率高等优点,并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶,用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。
实验方法原理 | 血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、用样量少和分辨率高等优点,并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶,用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。 根据凝胶形状不同分为盘状电泳和板状电泳。盘状电泳是在直立的玻璃管中,利用不连续的缓冲液pH值进行电泳而命名,同时,样品混合物分开形成的带很窄,呈圆盘状,因此圆盘电泳这个名字成了不连续性和盘状的双关语。不连续盘状电泳具有很高分辨力,这是由于有三种效应存在、浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 1.浓缩效应: 管中装有三种不同的凝胶层,见附图,上层为样品胶,第二层为浓缩胶,这两层均为大孔胶、其缓冲为Tris-HCL缓冲液pH值为6.7。第三层为分离胶,该层为小孔胶Tris-HCL缓冲液,pH8.9。在上下电泳槽中充分以Tris-甘氨酸缓冲液,pH值为8.3。这样造成凝胶孔径、pH值、缓冲液的不连续性。在此条件下,HCL几乎全部电离为Cl-,甘氨酸有极少部分的分子解离成NH2CH2COO-,一般酸性蛋白质也能解离而带负电荷。当电泳系统通电后,这三种负离子同向正极移动。根据有效泳 动率的大小,最快的称为离子或先行离子(这里指Cl-),最慢的称为慢离子或随后离子(这里是NH2CH2COO-)。电泳开始后,快离子在前,在它之后形成一离子浓度低的区域,即低导区。电导与电压梯度成反比,所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后,则在快离子和慢离子之间造成一个不断向阳极移动的界面,由于蛋白质的有效泳动率恰好位于快、慢离子之间,因此蛋白质样品被夹在当中浓缩成一狭窄层,这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 2.电荷效应: 蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白区,但由于每种蛋白质分子所载有效电荷 不同,因而泳动率也不同,因此各种蛋白质样品按泳动率快慢顺序排列一个一个的圆盘区带。在进入分离胶时电荷效应仍起作用。 3.分子筛效应: 当被浓缩的蛋白样品从浓缩胶进入分离胶时,pH值和凝胶孔径突然改变,选择分离胶的pH值8.9(电泳时实际测量是9.5),使接近甘氨酸的pka(9.7~9.8),这样慢离子解离度增大,因而其泳动率也增加,此时慢离子泳动率超过所有蛋白质的有效泳动率,高电压梯度不复存在。此时各种蛋白质不仅由于其分子量或构型不同,在一个均一的电压梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受摩擦力不同,受阻滞的程度不同,表现泳动率不同而被分开。 |
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试剂、试剂盒 | |
实验步骤 | 一、试剂 |