非变性凝胶电泳,也称为天然凝胶电泳。在凝胶中蛋白质的分离取决于它所带电荷及分子大小。按丙烯酰胺凝胶孔径大小去筛分不同尺寸蛋白质的同时,在分离胶酸性 pH 条件下高电荷的蛋白质的泳动速度会更快。这种方法可以区分仅有一个电荷单位差别的分子。与 SDS-PAGE 电泳相比,非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率。
实验方法原理 | 非变性凝胶电泳通常是在高 pH(8.8)缓冲液条件下进行。这时,多数蛋白质带负电荷,并向阳极迁移。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 工作溶液配制 2. 工作溶液用量 (1)制备不同厚度电泳凝胶所需的溶液体积 制备两块 6 cm×8 cm 的凝胶 配制量应比实际用量稍多些。 (2)X% 分离胶的计算 3. 制备分离胶 (1) 按操作指南装配好灌胶用的模具; (2) 将 A 液、B 液和水在小的三角瓶或试管中混合(由于丙烯酰胺具有神经毒性。 应戴手套操作); (3) 在温和搅拌下,加入过硫酸铵,TEME 混匀。由于这一步中发生聚合,动作要迅速; (4) 将上述胶液用滴管移入凝胶模具; (5) 加完分离胶后,立即轻轻在其顶部覆盖 1~5 mm 的水垣; (6) 静置 30~60 min,待凝胶聚合;当凝胶聚合后,在分离胶和水层之间将出现一个明显的界面,这时将凝胶稍微倾斜。 判断凝胶是否聚合。 4. 堆积胶的制备 (1) 除去覆盖在分离胶上的水层; (2) 在小三角烧瓶或试管中,将 A 液,C 液和蒸馏水混合; (3) 在温和搅拌下,加入过硫酸铵和 TEMED,混合均匀; (4) 吸取堆积胶溶液加到分离胶之上,直至溶液到达前玻璃板的顶部。 (5) 将梳子小心的插入到两块板之间,直至梳子齿底部到达前玻璃板的顶部,在梳子齿端避免留下气泡。 (6) 放置 30 min,堆积胶可聚合; (7) 待堆积胶聚合后,小心的取出梳子,不要使加样孔裂缝; (8) 将凝胶置入电泳槽中,并接好正负电极; (9) 将电泳缓冲液加入内外电泳槽中。 确保凝胶的上部和底部都浸在缓冲液中。 5. 样品制备 (1)加样孔的样品容量(Mini-Gel 系统) (2) 将蛋白质样品和样品缓冲液(20 ul + 5 ul)在 Eppendorf 管中混匀; (3) 用微量注射器将样品加入加样孔中; (4) 在加入不同的样品之前。用注射器抽吸少量的电泳缓冲液冲洗注射器,以避免样品间的相互污染。 6. 电泳 (1) 将电极插头与适当的电极相接,对于体育 pH 8.8 的凝胶,电流应流向阳极; (2) 将电压调至 100~200 V; (3) 电泳值示踪染料的前沿迁移到距凝胶底部约 1~5 mm处; (4) 关闭电源; (5) 拔掉电极插头; (6) 取出电泳凝胶板,放在一个安全的地方,轻轻撬开凝胶两边的玻璃板,使胶粘在其中的一块板上。 7. 凝胶染色 (1) 戴手套,将凝胶转移到一个含有约20 ml考马斯亮蓝的培养皿内; (2) 在摇床上缓慢震荡,0.75 mm 的胶需要 5~lO min。1.5 mm 的凝胶需要 10~20 min,; (3) 去除染液; (4) 加入约 50 ml 脱色液,继续轻微震荡; (5) 为了脱色完全,需数次更换脱色液并震荡过夜;可进行干胶保存。 展开 |