蛋白质凝胶染色法实验

总蛋白质的检测

1. 总蛋白质色度法染色

简便的目视检测、相对简单的使用及广大熟悉方法的用户基础群，使得考马斯亮蓝(C B B )—直是最普遍使用的总蛋白质凝胶染色剂。如需要比考马斯亮蓝染色更高的检测敏感度，那么银染法是可选择的色度方法。如果需要对切下的蛋白质进行质谱分析，则首选不会引入共价蛋白质修饰的染色方法。

总蛋白质的检测

1. 总蛋白质色度法染色

简便的目视检测、相对简单的使用及广大熟悉方法的用户基础群，使得考马斯亮蓝(C B B )—直是最普遍使用的总蛋白质凝胶染色剂。如需要比考马斯亮蓝染色更高的检测敏感度，那么银染法是可选择的色度方法。如果需要对切下的蛋白质进行质谱分析，则首选不会引入共价蛋白质修饰的染色方法。

考马斯亮蓝染色

考马斯亮蓝 R -250 及其二甲基衍生物考马斯亮蓝 0 2 5 0 均为三苯代甲焼二横酸盐染料 ，能将蛋白质条带染成亮蓝色。染色条带通过静电作用同质子化了的碱性氨基酸 (赖氨酸 、精氨酸和组氨酸) 相互作用，并通过疏水作用与芳香族残基的疏水缔合。染料不与聚丙稀酰胺高亲和力结合，但却会渗透凝胶介质并与其低亲和力结合, 因此需要脱色步骤，除非染液为胶体配方。通常采用考马斯亮蓝作为终点染色剂，其为固定和染色步骤提供
重要的灵活应变的时间。考马斯亮蓝染色剂是非共价且可逆的，并且不会干扰随后切+的蛋白质条带的质谱分析。

考马斯亮蓝R-250的染色在酸性乙醇条件下完成，用量为考马斯亮蓝R -250
0.025%〜0.10%(m/V 染液）、30%〜 50%( V/V) 甲醇（或乙醇，不及甲醇常用）搭配7 % 〜1 0 % ( V /V ) 乙酸溶液。染料溶解后将溶液用 W h a t m a n 1 号滤纸过滤，产生稳定的组成 。固 定 和 染 色 通 常 在 约 1 0 倍 凝 胶 体 积 的 溶 液 中 完 成 ，如 标 准 的 微 型 凝 胶 需 要50 m L 。为追求最敏感和始终一致的结果，凝胶的固定和染色需要在同样的乙酸溶液中进行。在此条件下，凝胶发生收缩。在 7 % 乙酸中脱色，减少乙醇可以使凝胶恢复完整大小 。脱色通常需要几次溶液的更换，加人染料吸附纸或泡沫橡胶/塑料可加速脱色。

在完全分析考马斯亮蓝染色法后，可得知, 胶体配方不利于染色剂有效进入胶体介质之 中 会 特 定 结 合 在 蛋 白 质 带 上 ，从而使定量可靠, 灵敏度也越加接近上文所述标准考马斯亮蓝 R -250 染 g 法 ，使低背景的染色成为可能。用于胶体染色剂时，考马斯亮蓝250 要优于考马斯亮蓝 R -250。初始配方是将〇.1 % 考马斯亮蓝 g _250 溶 解 在 2% (?w/v)
憐酸 ，6% 〇 n /V ) 硫 酸 铵 中（Neuhoff et al. ，1985)。一 种 改 善 的 广 泛 使 用 的 配 方 为 ，将10%( W V ) 硫酸铵溶解在 2 % W V ) 磷酸中，随后加入 5 % ( m /V ) 考马斯亮蓝 0 2 5 0 储备水溶液至终浓度为〇.l % ( w /V ); 染色前需先加人甲醇至终浓度为 20%(V /V ) ( N e u h o f fet al.，1988)。添加甲醇可增加单分散染料的比例, 会导致染色加快，条带明显，但一些背景色也会变明显; 增加硫酸铵的浓度会驱使染料变成胶体状态。此外, 更新的配方建议加大染料和磷酸浓度，即最终配方中应含有 0.12%( m /V ) 染 料 、1 0 % ( OT/V ) 硫 酸铵、1 0 %(m . V ) 磷酸及 2 0 % ( V /V ) 甲醇，所有成分形成单一的稳定溶液。制备时, 需要依次在水中加入上述量的磷酸、硫 酸 铵 及 粉 状 染 料 ，至 终 体 积 的 8 0 % ，然后加人甲醇至终体积(Candiano et al. ，2 〇〇 4)。胶体染料溶液不能过滤。

大部分商业渠道可获得的考马斯亮蓝染料配方，是在上述各种配方和方案的基础上衍生而来的。

关于固定的建议众多，在电泳后用水清洗凝胶以除去染料溶液中的多数 S D S , 清洗时间可以是几小时至过夜, 该简单程序有助于观察到良好的结果。蛋白质条带在几分钟内就可以观察到, 背景起初澄清, 最后呈淡蓝色。染色之后用水清洗凝胶以减弱背景。最近有一个简单实用的考马斯亮蓝染色方案的总结，包括一种「热」考马斯亮蓝染色方案，即在90°C 用基于乙酸的考马斯亮蓝 R -250 染液配方染色; 或是一种「快速」的 5(T C 下基于三氯乙酸的考马斯亮蓝〇——250 胶体染料的方案 。可由商业渠道获得的 一
些方案还包括利用简单的基于微波炉加热的方案来加速考马斯亮蓝 0250 胶体染料的染色 (和脱色）。

银染法

人们普遍认为银染法是其他所有超灵敏的染色方法的标准，是最复杂和可变的蛋白质凝胶染色方法学，已有好几十个已出版的方案，所有的方案都需要若干个阶梯式的步骤; 蛋白质检测的基础是将与蛋白质相结合的银离子还原成金属银，或者如较少情况下在某些方案中出现的，造成局部的硫化银沉淀。银染法可以作为极限检测灵敏度的严格标准 ，而定量不是一个简单的任务，它取决于显色步骤的复合物的性质和不同蛋白质间的银信号灵敏度的差异。有商业渠道可获得的银染试剂盒，试剂盒采用各种文献中的经过验
证的方案和试剂混合物，能够为初次使用者提供可重复的结果。对于那些想要改进和优化用于常规内部使用的「自制」银染试剂和方案的人来说，这也是一种重要的学习和基准确立工具。 Merril(1990)、R a b i U o u d (1990) 和 P o l a n d 等 (2005) 修订和总结了 银 染 法 的 原
理 、方法及方案。

关键步骤通常如下所述。

(1) 固定凝胶，以固定蛋白质条带，并移除凝胶中的干扰物质, 如 S D S 、缓冲液和盐，这些物质会结合银并造成背景染色。

(2) 用能够结合蛋白质并提高银结合能力的物质, 或是能够干扰剩余未结合的银造成的背景染色的物质来孵育凝胶。总之，这些各种各样的方法都和敏化作用有关。

(3) 银离子浸泡处理凝胶。

(4) 结合的银离子还原成不溶且可见的金属银，便出现了有色度的银染信号。

(5) 终止显色过程，以防止凝胶介质中的背景染色遮掩住蛋白质条带。后两个步骤对时间的依赖导致了技术的复杂性, 步骤 (2)〜(4) 中几次需要一定时间的清洗步骤也是如此。

银染法在银试剂和相应显影条件的基础上明显存在区别。碱性法将碱性环境下一种银的二元胺复合物作为银试剂, 并在酸性甲醛溶液中显影; 酸性法将弱酸性硝酸银作为银试 剂 ，并在碱性甲酸溶液中显影。酸性染色法最近变得更受欢迎，因为它相对于碱性法降低了成本，并且背景染色也更容易控制。

目前有很多增敏剂。芳香族横酸盐 (如二磺酸萘或磺基水杨酸) 能结合蛋白质，也能结合银; 剩余的与蛋白质结合的 S D S 也可以加强银的结合力。同样的，已被考马斯亮蓝染色的凝胶，如果再进行银染，同样可以提髙银染的强度。戊二醛作为增敏剂得以广泛使用, 其原理在于引入了还原性醛基，能同蛋白质中的自由氨基相结合。硫化试剂，如连四硫酸盐或硫代硫酸盐能在蛋白质附近引入自由 S2- ，该离子会立即与银离子反应并形成不溶的硫化银。

因为在固定和增敏过程中使用戊二醒会造成蛋白质修饰，故银染后进行的蛋白质质谱分析会有问题。那些能同质谱分析相兼容的方法都不使用戊二醛，而这可能会使敏感性相对降低。增敏步骤若依靠连四硫酸盐和硫代硫酸盐，显影步骤将会相应地延长。因此 ，若银染后需要质谱分析，可以先对胶体进行考马斯亮蓝染色，再进行无戊二醛的银染步 骤 ，这是一种便捷的两步估算出蛋白质样品纯度的色度方法。

Zn ²⁺ 反染法

在 S D S -P A G E 后 ，不依靠固定剂或有机染料，使用金属阳离子快速对蛋白质染色的方法有很多。 Z n ²⁺反染法利用的是蛋白质和蛋白质-S D S 复合物结合及隔离环境中的Z n ²⁺ , 而在此环境中咪唑和 Z n²⁺之间因沉淀反应会产生咪唑锌 (Z n I m 2), 并产生不透明的背景，同透明的蛋白质-S D S Z n ²⁺ 区域形成对比。该技术是一种非固定步骤, 在随后预期的微量分析，如洗脱条带的生物分析或酶分析中很有帮助，并且能同质谱分析或微量测序方法相兼容。该染色法迅速快捷，但检测灵敏度低于考马斯亮蓝染色法。

用 于 I m m 厚度的凝胶的 Z n ²⁺ 快速反染法步骤如下所述。

(1) 电泳之后，将凝胶浸泡在〇.2 m o l /L 咪唑、0.1% S D S 中 15 m i n 。

(2) 弃去咪唑溶液，再将凝胶浸泡人〇.3 m o l /L 硫酸锌孵育 30〜45 s 显影。

(3 ) 弃 去 上 述 显 影 液 ，用 水 清 洗 凝 胶 若 干 次 ，每 次 I m i n 。

(4) 将 凝 胶 保 存 在 0 . 5 % ( m /V ) 碳 酸 钠 中 。显 影 过 度 会 有 问 题 ，但 是 可 以 通 过 将 凝 胶 泡 在 1 〇 0 m m 〇 l/L 甘 氨 酸 以 溶 解 过 量 的Z n I m 2 来 解 决 。尽 管 不 透 明 背 景 下 的 透 明 蛋 白 质 条 带 没 有 像 考 马 斯 亮 蓝 染 色 法 或 银 染 法那 样 有 明 显 的 颜 色 对 比 ，但 是 可 以 在 黑 色 背 景 下 照 明 凝 胶 成 像（Fernandez-Patron，2005;
Fernandez-Patron et al. ，1998)