蛋白质凝胶染色法实验（三）

尼罗红蛋白质凝胶染色剂

尼罗红 (Nile red) 是一种吩囉嗪酮类染料, 当其从水转入到疏水环境，如 S D S 微粒或蛋白质-S D S 复合物中时，便显示出强烈的荧光增强作用。尼 罗 红 不 会 与 S D S 单体发生显著作用》利用这一特点开发出了一种适合 S D S 凝胶的迅速的不用固定的总蛋白质染色法。该方案要求电泳在非标准条件下进行，即电泳缓冲液 S D S 含 量 为 0. 0 5 % (m /V )，要 低 于 去 污 剂 的 临 界 胶 束 浓 度 ，而 不 是 通 常 应 用 于 一 维 和 二 维 S D S -P A G E 的 0. 1 %(m/v ) 的 S D S 含量。蛋白质样品制备要符合规格 (Garn n ,1990a ;1990b )，如 此 S D S -蛋白质复合物在电泳时才会保持稳定, 蛋白质条带的迁移也被认为是正常的。这种方法简单快速: 将尼罗红储备液 (0.4 m g /m L 保 存 在 D M S O 中）在 水 中 稀 释 200 倍 ，至终浓度为2 ug/m L , 每块凝胶加人超过 1 0 倍胶体积的染液 (如 一 块 5 m L 的微型凝胶需要 50 m L染色液) 并立即充分搅动。染料在水中会快速地沉淀，故最理想的染色应该为 2〜5 m i n ，超过这个时间效果也不会增强。染色之后, 用水简单地清洗凝胶。可用紫外线或绿光光源激发, 蛋白质条带会出现淡红色。本法检测灵敏度与考马斯亮蓝染色法相似。因为没有 固 定 ，尼 罗 红 染 色 的 凝 胶 在 随 后 电 泳 印 迹 转 移 时 有 较 好 的 转 移 效 率（ D a b a n ，2001;D a b a n et al.,1991)。染料的沉淀会在凝胶介质中形成高荧光背景，并 且 染 料 对 S D S 胶团的亲和性加上染料的不溶性使得该方法不能用于电泳缓冲液中含 0•1 % S D S 的 S D S ^P A G E 。染料的光稳定性也存在问题。

S Y P R O O r a n g e、S Y P R 〇 R e d 和 S Y P R O
Tangerine 蛋白质凝胶染色剂

S Y P R O R e d 和 S Y P R O O r a n g e 蛋白质凝胶染色剂是由 Steinberg 等 (1996a ;1996b )和 H a u g l a n d 等 (I” 7) 描述 的 ，S Y P R O T a n g e r m e 蛋 白 质 凝 胶 染 色 剂 是 由 Steinberg 等(2000b ) 和 Y u e 等 (2003) 描述的，所有这三种染色剂也同样经 Steinberg 等（2005) 讨论过 。这些染色剂含有一个亲水官能团、一个芳香族的荧光团及一个脂肪族尾部，使染料既具有良好的水溶性，又具有很强的插人蛋白质-S D S 复合物、S D S 微粒或膜的能力, 非极性环境下还有强烈的荧光增强作用。这些特征，再加上良好的化学和光学稳定性，可使染料以简便多样的染色步骤通用于标准缓冲液条件 (〇. 1 % S D S )S D S ——P A G E 后的染色，其检测敏感度超越了胶体考马斯亮蓝 0 2 5 0 染料。非标准缓冲液条件下 (0.05% S D S ) ，这些
染料与尼罗红相比染色敏感度可增加 4 倍, 但这对它们的使用不是必需的。

S Y P R O O r a n g e 和 S Y P R O R e d 为受ZL保护的磺丙基氨基氨基苯乙烯基（ sulfopropylaminostyryl) 染料，在市面上可以买到，其规格为溶解于 D M S O 中 的 10 m m o l /L 储备液。染色方法很简单:① S D S - P A G E 后 ，将凝胶放在染色液里;②图像采集之前, 用水简单清洗凝胶。

制备染色液时, 在乙酸 [标准为 7 % ( V /V )，2 % 〜1 0 % 都有同样效果] 中将染料稀释5 000 倍 至 2 umol/L 。染色液通常需要现配，但也能稳定保存数月。电泳之后将凝胶放在凝胶体积 10〜2 0 倍 (一 块 5 m L 的微型凝胶对应 50〜100 m L ) 的染色液中，染色液放在聚丙烯或聚碳酸酯碟中并持续温和地搅拌。将装有凝胶的染色液碟置于紫外线灯箱或
蓝光透照仪中可定期监控染色情况, 还可以通过手持式紫外线灯或蓝光 L E D 监测染色情况 。通常对于 10 ug 的细胞裂解物，在荧光背景下 10 m i n 或 15 m i n 就可以看到大量蛋白质的荧光条带。随着染色过程进行，蛋白质条带信号增加，而背景减弱、丰度较小的蛋白质的条带也变得更明显。对 于 I m m 厚的凝胶，染色可以在 I h 内完成，且凝胶在染色液
中放置数日都是稳定的。蛋白质-S D S -染料复合物在稀释的乙酸中是稳定的, 但剩余的S D S 会从凝胶中扩散出来, 造成弱背景现象。因此应该最小限度地脱色。图像采集之前 ，需要用水清洗凝胶以移除凝胶表面的剩余染料、S D S 和乙酸，清洗时水需要更换两次 ，每次清洗需要 2〜3 m i n 。

S Y P R O T a n g e r i n e 蛋白质凝胶染料为一种受ZL保护的昨哩基乙稀基（carbazolylvinyl) 染 料 ，根据推荐的染料稀释液和预期用途，可 将 其 与 S Y P R O O r a n g e 和 S Y P R OR e d 蛋白质凝胶染色剂区分开来。这种蛋白质染料可在中性 p H 缓冲液 (50 m m o l /L 鱗酸盐、150 m m o l , ‘L N a C l ,p H 7. 0) 中使用，此时蛋白质条带不会被固定，而且随后可进行酶谱分析、洗脱、复 性 ，从而用于分析其离体活性或电转印迹。商业渠道获得的染料为10 m m o l /L 的 储 备 液 ; 染 色 液 由 此 稀 释 5000 倍 至 2 u m 〇 l/L , 现 用 现 配 。染色过程与S Y P R O O r a n g e 相 同 ，I h 内可完成; 图像采集之前用水清洗凝胶。利用紫外线光源或蓝光光源来完成光谱激发。

SYPRO R uby 蛋白质凝胶染色剂和其他基于钌的配方

诸 如 S Y P R O R u b y 蛋白质凝胶染色剂这样的用于检测凝胶中或印迹上的蛋白质的基于有机金属钌离子的发光染色剂，可以用简单的终点染色法步骤，提供与银染法相媲美 ，甚至超越银染法的荧光检测敏感度，还 被 引 入 S D S ——P A G E 后 (Berggren et al. ,2000)或等电聚焦电泳后 (Steinberg et al.2000a) 的即用型染色液配方中。这些染料的发展与配方是以胶体考马斯亮蓝染色方案为基础，其中的有机组分螯合发光的钌 (II) ，并且以同考马斯亮蓝染色法类似的方式为非共价蛋白质提供了基础，即首先与碱性氨基酸发生离子作用，其 次 再 发 生 疏 水 作 用 。（4,7-二 苯 基 -1， 10-菲 绕 啉 酯）钌 [ruthenium II tris
(bathophenanthroline disulfonate)] 制备、染 色 方 案 及 与 S Y P R O R u b y 蛋白质凝胶染色法的比较的详细说明告诉我们，S Y P R O R u b y 的染色原理与钌染色法很相似; 质谱分析反映出二者的一些微小差异，这些差异是由它们专有的化学性质引起的。随 后 S Y P R O
R u b y 凝胶染色剂得到改进，最初配方的性能得到提升, 成为了一种适用于 S D S ——P A G E 和等电聚焦凝胶的即用型染色液 (Berggren et al, ,2002)。因 此 S Y P R O R u b y 与钌染色法的不同之处不仅在于突光化学方面，更重要的在于染色液配方方面, 即其拥有稳定的即用
型染色液和相对简单的染色方案。

⑴ 用 5 0 % (V/V) 甲醇、1 0 % 0 VV ) 乙酸固定凝胶，固定时间为 30 min 至过夜。

(2) 凝 胶 用 S Y P R O R u b y 染 料 染 色 。这 是 一 种 终 点 染 色 法 ，染 色 3 h 至 过 夜 ，性质稳定。