小鼠胚成纤维细胞的培养和体外分化_MEF滋养板的制备

胰酶溶液PBS明胶溶液

MEF 生长培养基组织培养皿

1. 准备下列材料

MEF 生长培养基

胰酶溶液

无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ PBS

丝裂霉素 C

明胶溶液（0.1%）

150 mm 组织培养皿

滋养细胞组织培养皿

2. 准备一支 15 ml 离心管，加 5 ml 预热（37℃）MEF 生长培养基。取一支液氮冻存的 MEF 细胞，37℃ 水浴中轻轻振荡，细胞融化后转移到离心管中。

3. 离心收集细胞，悬于 10 ml MEF 生长培养基，接种 150 mm 组织培养皿，加 MEF 生长培养基至 25 ml。37℃ 孵育至细胞长满（约 2~3 天）。

4. 细胞长满后加入丝裂霉素 C。吸掉培养基，加入新配制的含丝裂霉素 C（10 μg/ml）的 MEF 生长培养基。37℃ 孵育 2.5 小时。

5. 孵育同时准备明胶处理的滋养细胞培养皿。

(1) 0.1% 明胶溶液覆盖空的组织培养皿底，室温保温 15 分钟。

(2) 倒掉明胶溶液，培养皿晾干，平放待用。

6. 去掉培养基，10 ml PBS 冲洗三次，完全去除丝裂霉素 C，加 10 ml 胰酶溶液，37℃ 孵育 5 分钟。

7. 加 3 ml MEF 生长培养基，吹吸分散细胞，转移至 15 ml 离心管。

8. 离心收集细胞，悬于 10 ml MEF 生长培养基，计数细胞。

9. 丝裂霉素处理的 MEF 细胞以合适密度接种明胶包被培养皿。