小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养实验

孕鼠

PBS EDTA 胰酶 MEF生长培养基 FBS 高糖DMEM

眼科直剪 眼科直镊 眼科弯镊 玻璃平皿3 尼龙滤网 离心管 手术刀片

一、实验材料准备

1.   动物
 

孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
 

2.   试剂

无Ca²⁺和Mg²⁺的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
 

3.  器械
 

眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、具体操作

1.  处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.  用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。

3.  用200 μl的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃ 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4.   将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

5.  细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3×10⁷细胞)。

6.   3×10⁶细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。

7.  24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8.  细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟)，按1:5传代。

9.  细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。
 

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF 100倍)

1.   原代培养，一定要避免污染。
 

2.   MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。
 

3.  冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。
 

4.  消化细胞时间不要过长。