通过测定转染细胞的报告基因表达,如β-gal或CAT,可以确定导人的DNA是否已被整合到宿主细胞主要用于(1)测定基因表达(2)基因整合评价(3)细胞的调控。
来源于《动物细胞培养:基础技术指南(第五版)》
实验方法原理 | 氯霉素乙酰转移酶报告基因(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)能将乙酰基从乙酰辅酶A转移到氯霉素上。本试剂盒采用荧光测定的方法,检测CAT活性,它的灵敏度接近同位素测定方法,而操作极为简便、快捷,成本也大为降低。使用通用裂解缓冲液,能与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容。 |
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实验材料 | 细胞样本 |
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试剂、试剂盒 | Tris-缓冲液Tris 三硝基甲苯(Triton)CAT 稀释缓冲液CAT 酶标准物闪烁液聚丙烯闪烁杯 |
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仪器、耗材 | 微量离心管微量离心机 |
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实验步骤 | 一、材料 灭菌物品
1. D-PBSA
2. 多孔培养板:6 孔,35 mm
非消毒物品
1. Tris-缓冲液:Tris-HCl,0.1mol/L,pH8.0
2. Tris/三硝基甲苯(Triton):Tris-HCl,0.1mol/L,pH8.0,0.1%TritonX-100,4℃ 储存
3. CAT 稀释缓冲液:Tris-HCl,0.1mol/L,pH8.0,50% 甘油,0.2%BSA
4. 底物:含 250 mmol/L 氯霉素(GIBCO)的 100% 甲醇;分装,-70℃ 储存
5. 14C-CoA:14C-丁酸辅酶 A(10uCi/mL;AmershamPharmacia)
6. CAT 酶标准物:制备含 0.2、1.0、2.0、4.0、10U/mL 标准液的 CAT 稀释缓冲液,4℃ 储存
7.「鸡尾酒」闪烁液:Econofluor(Invitrogen)
8. 去离子蒸馏水(DDW)
9. 聚丙烯闪烁杯:3.5 mL
10. 微量离心管
11. 微量离心机
12. 冰浴
方法A:6 孔、35 mm 培养板上的细胞收集
1. 转染后 24~72 h,用 D-PBSA 液洗涤细胞。
2. 将培养板置于冰上,每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。
3. 将培养板-70℃ 冷冻 2 h。
4. 于 37℃ 下解冻培养板,然后将其置于冰上。
5. 将细胞裂解物移至微量离心管中,以最大速度离心 5 min。
6. 收集上清液,65℃ 加热 10 min,以灭活 CAT 抑制物质。
7. 最大速度离心 3 min 后收集上清液(细胞裂解物),将上清液保存在-70℃。
方法 B:CAT 测定
8. 从每一样品中取 5~150uL 细胞裂解物,移至一个 3.5 mL 多聚丙烯闪烁杯中,并且加入足够的 0.1mol/L Tris,终末体积为 150uL。
9. 设空白杯,加入 150uL 0.1mol/LTris 液,作为阴性对照。
10. 阳性对照: (a)取 5 个闪烁杯,各加入 150uL 0.1mol/LTris。 (b)将 5uL 的 CAT 标准液加入到每个闪烁杯中,绘制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 标准曲线。
11. 在所有样品杯(包括对照)中,加入 100uL 以下混合液: (a)84uL 超纯水 (b)10uL 0.1mol/LTris (c)1uL 的氯霉素 (d)5uL(50nCi)的 14C-CoA
12. 拧紧杯盖,于 37℃ 下孵育 2 h。
13. 向所有闪烁杯中加入 3 mL Econofluor,拧紧杯盖。
14. 上下倒置混匀闪烁杯中成分。
15. 室温下孵育 2 h。
16. 在一个液闪计数仪上测定 30s 闪烁次数。 展开 |
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注意事项 | 1. 在表达质粒扩增与制备一步,要特别注意其纯度(不能含RNA和染色体DNA)以免影响转化效率
2. 制备方法最好选用溶菌酶加Triton10,然后氯化艳梯度离心。
3. 一定要有对照组用CAT酶代替细胞提取液,来验证反应及层析等过程的可行性,或用Psv:CAT和Psv。cAT表达质粒验证转化及重组两步的正确性。
4. 在制备细胞提取液中最好选用超声波破碎法,离心前要注意检查破碎程度。冻融法繁琐有时破碎不彻底影响结果。
5. 4mmol/L乙酞辅酶A可每次取1.smg溶在500川水中,最好用前配制,配制的溶液可保存于一20℃,但不可超过十天。 展开 |
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其他 | 成功地组装表达质粒是该项检测技术的关键之一,表达DNA质粒必须具有下列几种元件:(1)供细胞复制的原核编码顺序和供啼选用的标记基因(抗菌素基因);(2)控制真核细胞转录的调控元件(增强子、启动子);(3)控制转录后的一些信号,转录加工裁剪信号,加尾信号,供在哺乳动物表达中用;(4)未知待测基因顺序可取代上述的转录调控顺序;(5)标记基因(氯霉素乙酸转移酶)。
参考: 1、《动物细胞培养:基础技术指南(第五版)》; 2、《霉素乙酞转移酶检测(CATassay)基础医学与临床》 展开 |
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