1) 准备下列液体,然后除菌并冷藏。
无酚红的 HBSS
NaCl 8 g KCl 0.4 g CaCl2 0.14 g MgSO4•7 H2O 0.1g MgCl2•6 H2O 0.1g Na2 HPO4•2 H2O 0.06 g KH2PO4 0.06 g 葡萄糖 1.0 g NaHCO3 0.35 g dH2O 1000 ml
Hoechst 1000x 贮存液
柠檬酸/磷酸盐缓冲液(2X)
0.1mol/L 柠檬酸 22.2 ml 0.2mol/LNa2 HPO4 27.8 ml 用柠檬酸或 Na2 HPO4 调节 pH 为 5.5。
2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化细胞于培养皿中的 Labtek 玻片上或盖玻片。
3) 加人 1~2 ml 培养液覆盖表面,让细胞生长 2~3 天。
4) 准备 Camoy 固定液(应在每次用前制备新鲜的)。
Camoy 固定液 3 份甲醇 1 份冰乙酸
5) 吸干培养液,不用洗涂单层细胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室内或培养皿中。培养皿中充满 Camoy 固定液(约 5 ml)室温中放置平皿 2 分钟。
6) 去除培养皿中液体,加人新鲜固定液以充满室内或培养皿中(约 5 ml)。室温中放置平皿 5 分钟。
7) 重复歩骤 6。
8) 去除固定液,去除 Labtek 室的塑料外套或将培养皿的玻片拿出,让细胞在室温中晾干 30 分钟或更长。
9) 用 Hoechst1000x 储存液(步骤 1) 配制 Hoechst 工作液。
Hoechst 工作液
工作液宜每次新鲜配制
用 10ml HBSS 稀释 0.1 ml Hoechst 储存液(0.5ug/ml)
用 5 ml HESS 稀释 0.5 ml Hoechst 储存液(0.05ug/ml)
或
用 50 mlHBSS 稀释 50ul Hoechst1000x 储存液;每 Coplin 染缸中加人 40 ml。
10) 室温条件下,在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液(终浓度为 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分钟。
11) 用 dH2O 漂洗两次。
12) 等体积混和甘油、梓檬酸/磷酸缓冲液(在步骤 1 中制备),制备封闭培养液以覆盖住细胞。
13) 在玻片和盖玻片之间加入 2 滴封闭培养液,用纸巾轻轻吸出多余液体。
14) 用橡胶黏合剂封闭玻片和盖玻片。
15) 用荧光显微镜观察标本。应用激发波长为 330/380nm 和光栅过滤器 LP440nm。 展 |