实验步骤 | 方 案 2.7 h E S 细 胞 的 手 工 传 代 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F 之上的未分化的 h E S 细胞集落 □ 新 鲜 的 M E F 板(最好是在失活处理后 1〜3 天内) □ h E S 培 养 基(见 2. 2. 1 节) □ 50 ul加样器枪头 □玻璃巴氏吸管 非无菌 □ 100M I 加样器,可调节的,调 至 50ul □火焰裸露的气体燃具或类似设备 □ 解 剖 用 倒 置 显 微 镜 ,最 好 有 一 个 可 设 定 37°C 的加热 台 ,放 在 I I 级层流罩中使用。 步骤 (a) 所有工作在无菌条件下进行,使用外科面具、手套,穿实验室外套。 (b ) 首先,用 500M1 h E S 培养基置换新鲜 M E F 培养板内的 M E F 培养基。 (c) 点燃煤气灯,用蓝色火焰烧玻璃吸管,轻轻旋转玻璃吸管,待柔软时拉长吸管产生比头发丝还要细的、密 封 的 狭 窄 末 端(图 2.1)。 (d ) 马上将所有拉好的吸管置于层流罩内保持无菌,吸管只能在传代时现拉,以减少污染的危险。 (e) 从温箱中取出 h E S 细胞培养皿放在加热的台子上。 (f) 根据它们的外观选择集落的未分化区域,未 分 化 的 h E S 细胞小而圆,紧密而透明。要避免选取棕色细胞区域(图 2.2),这个区域的细胞正处于自发分化状态。 (g) 用一个拉好的吸管的尖端,沿着未分化细胞区域切下,再切成较小的均等的块儿。典型的集落大小类似于图 2. 2 中所示,根 据 h E S 细胞系所特有的再生长率,可切 割 成 6〜10 块 。 (h ) 集落被切割后,用加样器安上合适的枪头吸取自由漂浮的小团块 (i) 将 集 細 』 转 移 至 新 的 M E F 血中,作为参考指南, —个新鲜 W M E F M可等量分配 4〜6 个较小的团块。 (j) 小心地将新旧 h E S 细胞培养皿放回温箱中,胞贴附,不要聚集在皿的中央。 (k) 第二天在新旧培养皿中再加入 250M h E S 培量换液吸去未贴附细胞的危险性。 注意:为了避免污染,每次伸入一个孔都要用新拉制的无菌的吸管 细胞反复暴露于酶,可能出现遗传改变,虽然必须注意这个问题,但这种方法适合于 h E S 细胞的大批量培养 方案 2 . 8 用肢原酶进行 h E S 细 胞 的 传 代 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F 之上的未分化的 h E S 细胞集落 □ 新 鲜 的 M E F 板(最好是在失活处理后 T〜3 天内) □ PBSA □ h E S 培养基 □ 溶 解 于 P B S A 的胶原酶 IV 溶 液(200 U /m l ) □细胞刮或拉长的玻璃吸管(见方案 2. 7) □机械加样器和吸头 □ 离 心 管 , 15 ml 步骤 (a) 吸 去 h E S 皿中的培养基,四孔板中的每一个孔用 500pd P B S A 洗两次。 (b) 每孔加人 500/xl 胶原酶 IV 溶液, 37°C 孵 育 8〜 lOmin。 (c) 用一个拉长的玻璃吸管轻轻地分离集落。 (d ) 用机械加样器将细胞转移至无菌的 15m l 离心管中。 (e) 用 750ul 新鲜的 h E S 培养基淋洗 h E S 培养板,将所有细胞集落收集到同一离心管中。 (f) 用加样器在 15m l 离心管中将集落打碎形成 I O 块或更多的小块。 (g ) 750 g离心 2m i n 。 (h ) 小心吸去上清,用 5m l 新 鲜 h E S 培养基重悬细胞。 i) 在 新 鲜 M E F 板的每个孔中,沿四周接种 4〜6 个团块。 ii) 将新接种的 h E S 细胞放入温箱中,贴附过夜,第二天加入新鲜的 h E S 培养基。 展 |
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