多克隆抗体提取实验——Tris-PO4 离子交换层析法

DE32纤维素DE52纤维素梯度洗脱液Tris-PO4

层析柱透析袋紫外分光光度计

一、材料和试剂
 

1.  DE32或DE52纤维素。
 

2. 待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
 

3. 1.5x50 cm 层析柱；透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。
 

4. 梯度洗脱液包括：0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO₄ ；0.055 mol/L，pH6.0 Tris-PO₄ ；0.5 mol/L，pH5.1 Tris-PO₄ 。
 

二、操作步骤
 

1. 蛋白标本对0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4 透析。
 

2. DE52装柱，并以0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4 平衡。
 

3. 加样，以0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4 洗脱，紫外监测直至洗脱液280 nm OD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。
 

4. 以350 ml 0.055 mol/L，pH6.0 Tris-PO4 洗脱，这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。
 

5. 以125 ml 0.055 mol/L，pH6.0 Tris-PO4 和125 ml 0.5 mol/L，pH5.1 Tris-PO4 梯度洗脱，总量收集250 ml；重复步骤（5）。
 

6. 根据280 nm峰值合并蛋白峰，透析浓缩和保存同上。
 

用过的DE52可用0.01 mol/L，pH8.6 Tris-Cl和0.5 mol/L NaCl、0.01 mol/L，pH8.6 Tris-Cl梯度洗脱回收。再用蒸馏水洗至中性，加入0.02%叠氮钠于4℃保存备用。