小鼠免疫实验_ 制备免疫脾细胞：用可溶性抗原致敏

PBS完全和不完全弗氏佐剂抗原

22－G 注射针头带塞的 3 ml 注射器双头带塞的连接器无菌剪刀剃须刀片解剖刀片木制涂棒

1. 准备等体积 PBS 含 25～100 μg 抗原和弗氏完全佐剂的乳化液（200～400 μl/鼠）。用双头带塞的连接器连接两个注射器，一个注射器装抗原，另一个装佐剂。来回推压注射器，使得其内容物从一侧到另一侧注射器，推压 5～10 min 直到得到稳定的乳化液。

2. 用 22－G 的针给小鼠腹腔注射（每一个抗原 3～5 只小鼠）。

3. 3 周后，用等体积的含 10～50 μg 抗原的 PBS 和不完全弗氏佐剂配制成（200～400 μl）的乳化液再次腹腔注射。

4. 第二次免疫后 7 天，用无菌剪刀或剃毛刀片切掉小鼠尾巴 0.5 cm 采血。收集 100～200 μl 血装于 1.5 ml 的微量离心管。将小鼠放在产热灯下 30～60 s 保暖或用拇指和食指挤压尾巴可以方便采血。

5. 血块形成后，用木制涂棒把血块从管和表面移走，不要弄破血块。移走血块后，用 200μl 的移液器把血清装入另一微量离心管。经 ELISA 确定血清抗体滴度。如有需要，用免疫印迹，进一步对抗体定性。

6. 如果滴度太低不能用于融合（≥1/1000），每两周给小鼠加强免疫直至达到足够的应答。如果采血超过 3 次，用剃毛刀切开一侧尾静脉采血。

7. 当抗体滴度足够高时（≥1/1000），融合前 3 天，但要在前一次免疫的 2 周后，用含 10～50 μg 抗原的 PBS 溶液腹腔注射（200～400μl）或经皮下尾静脉（50～100μl）注射加强免疫。

8. 在强化免疫的 3 天后进行细胞融合。

处理弗氏佐剂要小心，因为自注射会产生阳性的 TB 试验，导致肉芽肿样反应。