标记抗体的应用技术——化学发光免疫分析

抗体抗原血清

NaHCO3缓冲液抗体稀释液

加样器试管聚苯乙烯珠洗瓶、抽滤装置

1.  包被抗体　

在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300 μl用0.05 M，PH9.6 碳酸盐缓冲液稀释的抗HBsAg抗体，同时设空白对照，置4 ℃过夜。

　　
2.  洗涤　

用抽滤针头吸干管内液体，加入Tris-HCl-Tween20洗涤3 次，每次加2 ml，放置3～5 min，用抽滤针头吸干管内液体。

　　
3.  加待检血清和阳性标准品　

用PBS-Tween20缓冲液不同倍数稀释HBsAg阳性标准品或待检血清，每管加入300 μl。同时设阴性对照，空白对照管只加抗体稀释液。置37 ℃孵育2 h。

　　
4.  洗涤　

同2。

　　
5.  加酶标抗体　

用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg抗体，每管加入300 μl，空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37 ℃孵育2 h。

　　
6.  洗涤　

同2。

　
7.  化学发光测定　

给每管加入300 μl底物溶液，置37 ℃保温20 min。然后将小试放入LKB-1250 lumimeter中，并置于测量位置，加入300 μl 5.0×10－4 M luminol。记录仪记录化学发光强度。

　　
8.  同时用ELISA方法进行对照，结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。

1.  洗涤要彻底，以免因血清中其他来源的过氧化物酶类物质所产生的非特异性反应，而影响测定结果。

　　
2.  实验中，应分别设置阳性、阴性、空白对照来控制实验条件，且每份样品均应做三个复管，以保证实验结果的准确性。

　　
3.  为了克服酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，可用适量小牛血清加以抑制。

　
4.  当加入luminol后，迅速产生化学发光并使发光在一秒钟内达到峰值，然后很快衰减到基线水平。因此，只有当小试管置于仪器的测量位置时，方可加入luminol。

　　
5.  底物的加入，是为了增强化学发光强度。但只有当底物分子与酶催化活性中心充分接触时，反应速度才能加快。当反应进行15 min达到平衡时，牷学发光强度则不再随时间的延长而变化，且在1 h内保持稳定，因此，控制底物与酶反应15 min后加luminol进行化学发光测定。

一、结果判定

1.  定性　

按下列公式判别阴、阳性

　　　L样品－L空白　　      ┌≥2.1　为阳性

S/N ＝ ────────　＝　商│

　     L阴性对照－L空白   　 └＜2.1　为阴性

　　
2.  定量　

以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标，不同稀释倍数为横坐标，作出剂量反应曲线（标准曲线），待测样品中HBsAg的含量就可由测量的化学发光强度换算得到。