单层细胞

PBS多聚甲醛甲醇抗体

离心机水浴锅培养箱

1.  置生长成片的单层细胞于冰上冷却，吸去培养液并以4℃PBS洗涤。吸去PBS。

2.  如欲研究细胞表面抗原，则以2%PFA于冰上面定30 min。如为细胞质抗原，则可用含0.1% Triton X-100的2%PFA于冰上固定30 min，或以100%甲醇在普通冰箱的结冻室（-10~-20℃）固定15 min。

3.  吸去固定液，用4℃PBS洗2次（毎次5 min）。稀释的笫一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min。

4.  加第一抗体于培养皿中，使其恰好覆盖细胞，4℃温育1 h，然后用4℃PBS洗4次（每次5 min）。

5.  稀释的笫二抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min。

6.  加第二抗体于细胞上，4℃温育4 h。然后用4℃PBS洗4次。

7.  若不想立即观察细胞，则将细胞于PBS中存放。盖好培养皿，以铝箔包裹，冷藏，在24 h 内观察此实验结果是很重要的，因荧光会迅速减弱或与细胞解离。

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：

    (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;

    (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;

    (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。