B 细胞功能的检测

基 本 方 案 1 抗原特异性的抗体产生

材 料

200ul 完全培养基重悬细胞（两种板）。在测定前将细胞置于冰上。

基 本 方 案 2 Jerne-Nordin PFC 测定法

材 料

2 X R P M I 1640 培养基中含碳酸氢盐（Invitrogen)

SeaPlaque 低 熔 点 琼 脂 糖（F M C BioProducts)

5.—次 分 配 50 ul T N P -S R B C 到 6〜8 管中。检 测 1 或 2 张玻片，将混合物倒在玻片上并沿管子边缘扩散开（玻片是橙红色）。

6 .从洗涤过的培养板中的第一孔转移 IOOul 细 胞 出 来（如果用多克隆刺激剂可用小点的体积，如 20〜50ul; 如果诱导剂很弱可以用大点的体积，如 120ul)，吹打孔底多次使得所有的细胞都转移到含琼脂糖的第一管中。

7 .将水浴中的玻璃管拿出，紧握住玻璃管防止溅出内容物，用 有 2 片纱布的橡皮垫的混和器混旋。颠倒玻璃管将混合物倒入第一张玻片。迅速通过玻璃管管口扩散琼脂糖于玻璃表面上。

8 . 重复步骤 6 和 7 处 理 完 1 0 个管子；在玻片干之前不能移动，也不能使它们表面向上太长时间否则会干掉。在第一批 5〜1 0 个玻片做好之后，将它们上面朝下放在自制的玻片盒上。

9 . 剩余的玻璃管和玻片重复步骤 5〜8 直到所有的培养物都从管内转移到玻片上。

10.将 玻 片 盒（或玻片架和染色缸）重叠起来，将另外一个玻片盒放在上面，用湿布和大 塑 料 袋 盖 上（后者可选）。

11.在 无 C O 2 的 37°C 环境下培养 lh。

12.用 D P B S 稀 释 豚 鼠 补 体（通常每个玻片盒需要 48 ml 1 : 2 0 或 1 : 2 5 稀释的补体），温 和 混 匀（不要剧烈振荡），维 持 在 37°C 的环境下。

13.从玻片盒外去除湿布。用 IOml 或 20m l 移液管将稀释的补体从玻片的一端淹没玻片 ，移液管头要接近玻片的边缘，确保在玻片下没有气泡。

14.在无 C O 2 的 37°C 环境下培养 lh。

15.将玻片轻轻放在玻片架上，然后将玻片架浸泡在含有 0.85% (m /V ) 的氯化钠的染色缸中。

16.立即观察玻片或在 4°C 保存几个小时后观察。并 在 低 倍 双 目 解 剖 显 微 镜（放 大 10倍）下用间接光照亮琼脂糖层计数空斑数目。空斑在琼脂糖的 S R B C 层里显现成色圈样。如果在空斑处看到了颗粒，那么认为这是个假空斑

基本方案 3 Cunningham-Szenberg PFC 测定法

适当的吸收豚鼠补体对这项检测很重要。并 且 ，补体溶化后应该立即使用，不要再次冻存。所有的试剂应于室温时使用以避免在小室中形成气泡。玻片小室应该在灌满之后 的 20m i n 内用蜡封起来以避免干燥。

材 料

蜡（组织制备级）

含添加物的 R P M I 或 IF1 2 完全培养基

7.5% (V7 V ) S R B C 或 1 5 % T N P - S R B C (见辅助方案 3)

从培养细胞中洗涤的 B 细 胞（见基本方案 1)

完全培养基里的 5 0 % (V /V ) 豚 鼠 补 体（如 Life Technologies， ColoradoSerum)

120 cm2 玻璃培养皿

9 6 孔 U 形底微量滴定板

的 角 上（图 2.5. 2A )。

转 移 的 细 胞 数 目 应 该 调 整 为 不 多 于 75〜 IOOPFC/ 小 室 。

4.将它们浸没在热蜡中使小室的两边封闭（步 骤 1)。将玻片放置于玻片架上或 C O 2 培养箱的托盘上。并 在 37°C 条件下培养 lh。

5.用肉眼或者用 1 0 倍解剖显微镜计数空斑（通过模糊的边缘和没有反射性的特性与气泡相区别；图 2.5. 2B )，轻轻移动玻片防止摇晃，避免扰乱单层。

辅 助 方 案 1 制备琼脂糖包被的玻片

材 料

7 0 % 乙 醇

SeaPlaque 低 熔 点 琼 脂 糖（F M C Bioproducts)

一端磨砂的载玻片（如 Gold Seal Rite-O N 载玻片， Fisher)

玻 片 架 和 染 色 缸（Fisher)

烤箱

IOOml 玻璃瓶

43°C 水浴

载玻片盘

 

辅 助 方 案 2 制 备 Cunningham-Szenberg 小室

材料

7 0 % 乙醇

3inX I in X 0.93〜 1.05 mm 载玻片

玻 片 架 和 染 色 缸（Fisher)

干烤箱

0.25in 双 面 胶（如 3M )

滚 筒（如 25m l 移液管或者类似的圆形物体）

1.将 3in X l in X 0. 93〜 1.05m m 载玻片放于玻片架上。将 它 转 移 至 含 7 0 % 乙醇的染色缸内浸泡。移出玻片架将玻片在干烤箱内干燥 l 〇 m in。 然后使玻片冷却至室温。

2.将 15〜3 0 个玻片靠近排放，但是互相不接触。

3.将 0. 25in 双面胶贴于玻片两端和玻片的中间使得玻片被分成了两个 100/xl 部 分（图2. 5. 2A )

4.撕开双面胶的背面，将另一个玻片对齐粘上。

5.用滚筒轻轻地压玻片以使双面胶贴牢。使用的时候用刀片裂开玻片之间的胶带。

辅 助 方 案 3 三 硝 基 苯 半 抗 原（TNP) 偶 联 SRBC

材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)

双 甘 氨 肽（改良的巴比妥缓冲液）

l X M B B

2 ，4,6-三 硝 基 苯 磺 酸（T N B S ) ，钠盐

O .28mol/L 二甲砷酸盐缓冲液， p H 6. 9

辅 助 方 案 4 蛋 白 质 A 偶 联 SRBC

材 料

辅 助 方 案 6 用 Percoll 梯度离 心纯 化 静息 B 细胞

材料

IX 和 IOX Hanks 平 衡 盐 溶 液（H B S S ) ，不 含 镁（Life Technologies)， 4°C